Pour le moment, nous n’avons que quelques éléments de réponse. Premièrement, on ne sait pas si ce complexe RNAPII-snRNP U1 existe pour lui-même ou n’est que la conséquence d’une association plus grande. Cela est tout à fait concevable dans le contexte transcriptionnel. En
mi-tose, avec une RNAPII inactive, les associations sont en théorie plus restreintes. Pour autant, la RNAPII des cellules mitotiques se trouve aussi sous ses deux formesRN API IOetRN API IAet plé-thore de protéines sont associées au CTD de la RNAPII dont des protéines de l’épissage telles que SF2-ASF. Or on sait que SF2-ASF se lie à la protéine U1-70k[154, 65]. Cette association permet le recrutement plus efficace de la snRNP U1 au site 5’ss [77]. Si U1-70k est présent sur les immu-noprécipitations RNAPII en mitose, je n’ai pas regardé SF2/ASF. Mais on sait qu’il est présent sur les immunoprécipitations de l’article de Das et.al. Il faudrait donc déterminer si SF2/ASF joue un rôle dans l’association RNAPII – snRNP U1. Pour cela, on pourrait rajouter la protéine SF2/ASF sur des extraits nucléaires en concentrations croissantes et observer la proportion de RNAPII liée à l’ARN U1. Parmi les composants du splicéosome, je n’ai de résultats biochimiques qu’avec l’ARN U2 qui est peu enrichi. Par spectroscopie de masse, Das ne trouve que la protéine U2-A’[65]. Dans mes Northern blots et dans les résultats de spectroscopie de masse, les quantités sont faibles par rapport à la snRNP U1 et il n’est pas toujours aisé de savoir s’il s’agit d’un bruit de fond ou d’un réel signal U2. Dans les cellules synchronisées, on peut penser que l’interaction du snARN U2 avec la RNAPII existe car elle pourrait témoigner d’un voisinage avec le splicéosome. Dans les cellules mitotiques, le jugement est plus délicat. D’une part, les résultats de l’anticorps commercial sont certes meilleurs que les ascites (et enrichissent moins l’ARN U2), d’autre part, on voit quand même du U2. Cependant l’association de la snRNP U1 ne peut être la conséquence de l’association des UsnRNPs du splicéosome avec la RNAPII, d’abord parce que les extractions de splicéosomes ne contiennent pas de RNAPII [18, 52]et inversement[65, 301]. Ensuite la RNAPII est déjà un énorme complexe à elle-seule, il semble difficile qu’elle soit associée avec un complexe tout aussi gros qu’elle, sinon plus, dans la cellule. La présence du snARN U2 dans les couplages covalents dans les cellules mitotiques pourraient provenir des granules d’interchromatine mitotique (MIG). En mitose, laRN API IO peut se retrouver dans les MIG qui sont les speckles mitotiques. Elle y côtoie entre autres les snARNs de l’épissage. Les couplages covalents pourraient maintenir des interac-tions dans ces granules et permettre d’observer une interaction de l’ARN U2, qui est l’ARN le plus abondant après l’ARN U1, avec la RNAPII. Deuxièmement, la phosphorylation du CTD pourrait jouer un rôle dans l’interaction RNAPII – snRNP U1 bien que celui-ci reste à élucider. En effet, l’article de Das a basé sa recherche sur des immunoprécipitations avec l’anticorps 8WG16. Les
6.7. Pré-requis de l’interaction RNAPII – snRNP U1 145
auteurs l’ont choisi car de tous les autres anticorps testés (N20, H5, H14), le 8WG16 a été le seul à permettre de voir les protéines co-immunoprécipitées sur un gel de Coomassie. De même, Ka-meoka montre une immunoprécipitation 8WG16 qui enrichit spécifiquement l’ARN U1, plus que les anticorps N20, H5 et H14 qui co-immunoprécipitent les autres snARNs[137]. Or, dans mes ex-périences, c’est ce même anticorps qui me permet d’enrichir largement l’ARN U1 et ses protéines par rapport aux autres anticorps. Cet anticorps immunoprécipite les deux formes de la RNAPII (RN API IOetRN API IA), tout comme l’anticorps N20. A la différence près que l’anticorps 8WG16 reconnaît le CTD sur les peptides non phosphorylés et le N20 sur la partie N-terminale de Rpb1. Se pourrait-il que l’anticorps 8WG16 modifie la conformation de Rpb1 et/ou de son CTD et que celui-ci devienne plus attractif pour la snRNP U1 ? Actuellement, Bo Gu au laboratoire, tente de faire ex-primer une RNAPII-GFP avec un CTD pleine longueur (WT-CTD) ou un CTD réduit à 5 répétitions (δ5-CTD). Il serait intéressant de faire une immunoprécipitation anti-GFP après formaldéhyde et regarder si U1 s’associe à la polymérase tronquée. L’implication du CTD dans l’association de la snRNP U1 à la RNAPII est difficile à résoudre par les anticorps mais ce n’est pas le seul problème rencontré. En effet, dans les expériences de couplages covalents au formaldéhyde, on fixe les cel-lules dans un état mais on utilise aussi beaucoup de détergents, des sonications, pour casser les cellules et réaliser les immunoprécipitations. Au laboratoire, Praveen Belagal a mis en évidence une perte du CTD de la RNAPII au fil des sonications. Pour ma part, j’ai déjà observé ce phéno-mène parfois même sans sonication avec des conditions de lyse douces. Dans ce dernier cas, cette perte est peut-être due à des protéases encore actives. En conditions natives, on a aussi remarqué que la quantité d’ARN U1 immunoprécipité était beaucoup plus importante que sur des cellules fixées. Les ARNs U1 ou U2 immunoprécipités dans ces extraits sont-ils le reflet de la réalité ou bien en a-t-on perdu au cours du protocole ? Si le CTD est dégradé, il n’est pas reconnu par l’anticorps 8WG16. S’il est coupé, il l’est potentiellement. L’un ou l’autre cas peuvent avoir une influence di-recte sur la quantité d’ARN U1 immunoprécipité. On ne sait donc pas à l’heure actuelle quelle est la réelle proportion d’ARN U1 immunoprécipité avec la RNAPII (certainement au moins 1 pour 1, voire plus) et si cette RNAPII a pu conserver l’intégrité de ses associations. Une autre tentative de savoir si le CTD joue un rôle dans cette interaction est d’utiliser l’imagerie avec le plasmide codant pour Rpb1 δ5 cité ci-dessus. Nous avons cependant été confrontés à des problèmes techniques
d’expression de ce plasmide et pour le moment, nous n’avons pas de résultats fiables.