sous-unités dans cette structure.B.Ouverture de l’ADN dans le site actif de la RNAPII et synthèse du brin d’ARN qui fait contact avec le mur formé par Rpb2.
L’initiation commence avec la synthèse de la première liaison phospho-diester entre les deux premiers nucléotides[117, 57]. Au fur et à mesure que la transcription avance, le+1 est considéré comme le dernier résidu ajouté au pré-ARNm et la bulle se déplace le long du gène. Un élément de structure appartenant à Rpb1 et appelé hélice de pontage jouerait un rôle important dans la translocation de l’enzyme (schéma A). Après l’ajout du quatrième rNTP, il se produit un change-ment de conformation qui stabilise le complexe en conformation ouverte ou pinces « ouvertes ».
Dès lors, TFIIH n’est plus nécessaire au maintien de la bulle de transcription[144]. A l’intérieur de la bulle, l’appariement des rNTPs produit un hybride ARN-ADN de 8 à 9 nucléotides calé entre l’hélice de pontage (Rpb1) et le mur (Rpb2) (schéma B, mur en bleu foncé sur le schéma A),
in-teragissant avec une quinzaine de régions protéiques appartenant à Rpb1 et Rpb2[100]. Ces in-teractions créent une zone de haute complémentarité qui ne doit cependant pas être un frein au déplacement de la RNAPII. Entre 3 et 10 nucléotides polymérisés, la transcription est dite abortive car la RNAPII laisse échapper le pré-ARNm et recommence la transcription au site d’initiation. La RNAPII n’avancerait pas sur l’ADN mais le ferait se compacter à l’intérieur de la crevasse. Cette structure n’étant évidemment pas stable, la transcription ne peut se faire que sur quelques nu-cléotides. Pour changer d’état la RNAPII a deux choix possibles : libérer l’ARN pour libérer l’ADN de la crevasse ou maintenir l’ARN mais changer de conformation en cassant ces liaisons avec le promoteur. La dernière solution mène à ce qu’on appelle la fuite du promoteur et à l’élongation de la transcription[138, 258]. On ne sait pas bien quels sont les causes de ce phénomène et comment la RNAPII « choisit » entre ces deux solutions. Néanmoins, TFIIB y joue certainement un rôle car il possède un doigt B inséré dans la crevasse par le canal de sortie de l’ARN. Il doit être délogé pour permettre à l’ARN de sortir[29].
Après la synthèse d’une trentaine de bases, la RNAPII est sensée relâcher ses contacts avec le cœur-promoteur et le reste de la machinerie transcriptionnelle c’est ce qu’on appelle la « fuite du promoteur ». Pour permettre cette fuite, la RNAPII est phosphorylée sur les Ser5de son CTD par l’activité kinase de la sous-unité cdk7 de TFIIH[191, 320].
Facteurs négatifs et positifs de transcription, fin de la transcription
La RNAPII a donc initié la transcription, elle a quitté le promoteur. Mais d’autres facteurs inter-viennent pour stopper la transcription. Ce sont des facteurs négatifs de transcription qui la mettent en pause transcriptionnelle. La RNAPII est, à ce stade phosphorylée en Ser5. Elle a initié la trans-cription et est stoppée à 20–40 nt en aval du TSS. Cette pause est en partie due aux effets néga-tifs du facteur négatif d’élongation NELF et du complexe sensible au DRB (5,6-dichloro-1-β -D-ribofuranosylbenzimidazole ; inhibiteur de la transcription) DSIF/Spt4,5[54]. NELF comprend 4 sous-unités NELF-A, B, C/D et E. Il est conservé chez les mammifères mais est absent chez Caeno-rhabditis elegans,Saccharomyces cerevisiaeetArabidopsis thaliana[220]. NELF se lie à DSIF. DSIF est composé des facteurs d’élongation Spt4 et Spt5, conservés de la levure à l’homme. DSIF s’asso-cie à la RNAPII.In vivo, DSIF et NELF sont présents sur les gènes de choc thermique non induits de
1.2. Epissage 21
la drosophile et ces facteurs maintiendraient la pause transcriptionnelle dans la région proche du promoteur du gène Hsp70 puisqu’une immunodéplétion de NELF abolit la pause[6, 334]. Ils pour-raient interagir avec l’ARN car la sous-unité NELF-E se lie à l’ARN[92]. Cette pause est importante car elle permet la pose de la coiffe sur l’ARN naissant. Pour sortir de la pause et continuer l’élon-gation de la transcription, le P-TEFb (Positive Transcription Elonl’élon-gation Factor b) phosphoryle le CTD de la RNAPII sur lesSe r2et la sous-unité SPT5 de DSIF et NELF-E. Le P-TEFb est composé de 2 sous-unités : cycline T et sa kinase associée cdk9[247]. DSIF phosphorylé, NELF perd son in-teraction et se décroche du complexe. DSIF devient un facteur positif d’élongation. Le PTEF-b est recruté sur les gènes transcrits par la RNAPII par divers mécanismes pour la transcription d’une majorité de gènes, incluant les gènes de choc thermique et le gène c-Myc, et il est aussi requis pour la transcription du VIH en étant recruté par la protéine Tat[252, 354]. Même si le P-TFb reste asso-cié avec le complexe d’élongation, son activité kinase n’est plus requise une fois que le complexe est sorti de la pause[224].
La transcription se termine par la libération de l’ARN et de l’ADN[253]. La libération de l’ARN a lieu avec la coupure après le signal polyA et l’ARNm est polyadénylé. La RNAPII se détache de l’ADN grâce à la présence de séquences terminatrices. Une réinitiation de la transcription plus rapide est possible par le fait que certains facteurs restent asssociés au promoteur[344].
1.2 Epissage
L’ARNm transcrit n’est pas encore mature. Il subit plusieurs modifications (coiffage, épissage, coupure et polyadénylation) qui lui permettront d’être ensuite véhiculé et traduit. Parmi ces modi-fications, l’épissage est un événement indispensable de la maturation du pré-ARNm multi-exonique.
Celui-ci ne pourra être ni exporté ni traduit s’il n’est pas épissé.
L’ARN pré-messager est la copie parfaite du gène et contient de façon alternée exons (parties codantes) et introns (parties non codantes). L’épissage consiste en l’excision des introns et en la jonction des exons les uns à la suite des autres. L’épissage possède une autre propriété : celle de créer une grande quantité, parfois phénoménale, de transcrits à partir d’un seul et même gène.
Par exemple, le gène Dscam (Down syndrome cell-adhesion molecule) pourrait générer 38 016
variants d’épissage[273]et tout autant de protéines différentes. Cela est possible car il existe di-verses manières de faire de l’épissage alternatif. Les événements de base sont représentés dans la figure 1.7. Et pour un même gène muti-exonique, ces différents modes peuvent se combiner (fi-gure 1.7 H). L’épissage alternatif est loin d’être un cas exceptionnel mais plutôt une règle. En effet, 92% des gènes multi-exons peuvent donner au minimum deux transcrits distincts par l’épissage alternatif. En ne comptant que les gènes dont chaque isoforme représente au moins 15% dans un tissu, il reste encore 86% de gènes subissant l’épissage alternatif[321]. La plupart des épis-sages alternatifs affectent la séquence codante : la moitié altère la phase ouverte de lecture et le tiers conduit à la dégradation de l’ARNm par le système NMD (nonsense mediated decay)[200]. Le système NMD est un système de surveillance des ARNm qui détecte les ARNm possédant un codon-stop prématuré. Lorsqu’il est dérégulé, l’épissage alternatif peut être la source de maladies, notamment de cancers[322]. La dérégulation peut provenir de mutations encis(perturbation du code) ou entrans (perturbation de la machinerie d’épissage). Dans une étude récente, il a été proposé que 60% des mutations géniques causaient des maladies par un dérèglement de l’épis-sage (mutations encis)[190]. Les mutations entransprovoquent des surexpressions ou des sous-expressions de facteurs d’épissage qui ont pour effet de modifier les quantités relatives d’isoformes d’un ARNm. Ainsi, le facteur d’épissage SF2/ASF a été trouvé surexprimé dans plusieurs tumeurs humaines, affectant l’épissage alternatif de plusieurs gènes dont le suppresseur de tumeur BIN1, ce qui le conduit à la perte son activité suppresseur de tumeur. Les kinases MNK2 et S6K1 sont aussi affectées et l’isoforme résultante de MNK2 stimule la phosphorylation de eIF4E (protéine associée à la coiffe qui permet l’initiation de la traduction) indépendamment de la voie MAPK.
L’isoforme 2 de S6K1 est surexprimée se met à arborer des propriétés oncogéniques alors que cette protéine est impliqué dans la croissance cellulaire et dans l’apoptose[140]. A l’inverse, le facteur d’épissage U2AF35 est sous-exprimé dans d’autres types de cancer[112].
1.2. Epissage 23
FIGURE1.7 –Mécanismes élémentaires de l’épissage alternatif. A.Les exons en cassette sont des