l’IP contrôle (piste 4) et de l’IP RNAPII (piste 5).B.Panneau de gauche : NB U1, U2, 7SK sur cellules mitotiques traitées au formaldéhyde. Panneau de droite : NB U1, U2, 7SK sur cellules non syn-chronisées traitées au formaldéhyde.C.Quantification à partir de NB sur 3 immunoprécipitations RNAPII et contrôle indépendantes. Les pourcentages indiqués représentent les rapports IP/input des signaux obtenus.
Afin de vérifier que cette association n’était pas le fruit d’une reconstitutionin vitrolors de la lyse cellulaire, j’ai réalisé des couplages covalents au formaldéhyde sur ces cellules mitotiques.
Après sonication, les lysats sont clarifiés, et on procède à l’immunoprécipitation. Les ARNs puri-fiés sont détectés par Northern blot. Les rendements de l’immunoprécipitation sont très diminués avec le couplage covalent, on immunoprécipite en effet qu’environ un quart de la RNAPII totale (figure 5.4 A). Néanmoins, on observe toujours sur ces extraits l’enrichissement de l’ARN U1 avec la RNAPII (figure 5.4 B). En revanche, dans les cellules mitotiques, l’ARN 7SK n’est pas particulière-ment enrichi avec la RNAPII. De même, l’ARN U2 n’est pas largeparticulière-ment co-immunoprécipité avec la RNAPII. On en trouve tout de même un peu. Sur trois expériences indépendantes en cellules mito-tiques, on co-immunoprécipite un peu moins de 3% de l’ARN U2 sur environ un quart de RNAPII immunoprécipitée (figure 5.4 C). La proportion d’ARN U1 co-immunoprécipité s’élève à 7%. Si on ramène ces valeurs à la RNAPII totale, on peut dire qu’il y a environ 25% (4x7%=28%) d’ARN U1 associé à la RNAPII dans la cellule. Ce rapport est 2 à 3 fois inférieur à ce qu’on obtient sans for-maldéhyde. Cela peut s’expliquer de deux façons : soit l’ARN U1 est associé à la RNAPII par une protéine intermédiaire et cette association indirecte est partiellement perdue au cours des soni-cations, soit l’ARN U1 interagit avec la RNAPII par son CTD. Or, celui-ci a tendance à être perdu avec les sonications (figure 5.4 A, indiqué par la flèche). En ce qui concerne la présence d’ARN U2 sur la RNAPII mitotique totale, on remarque qu’elle est inférieure à celle de l’ARN U1 (de l’ordre de 10% puisqu’il y a 3% co-immunoprécipité avec un quart de la RNAPII). Il semble plutôt s’agir d’une association mineure, ce qui expliquerait pourquoi on ne la voit pas en l’absence de couplage co-valent. Cette association est d’autant plus mineure que sur 4 expériences, deux d’entre elles ne pré-sentent presque pas d’ARN U2 co-immunoprécipité. Cette variabilité entre les expériences pour-rait provenir en partie de l’anticorps utilisé. En effet, les plus importantes co-immunoprécipitation d’ARN U2 ont été observées avec des ascites de 8WG16, alors que l’anticorps commercial donne un enrichissement moindre en U2 et plus net en U1. Cette fraction d’ARN U2 associé à la RNAPII pourrait néanmoins avoir une signification biologique. La RNAPII est effectivement présente dans les granules d’interchromatine mitotique (MIG). Les MIG sont les speckles durant la phase mito-tique. Ils concentrent la RNAPII sous sa forme hyperphosphorylée et des facteurs d’épissage dont les snARNs. En utilisant des conditions de couplage covalent, on peut imaginer que les molécules
5.2. Autres anticorps anti-RNAPII 109
présentes dans ces MIG soient couplées les unes aux autres du fait de leur proximité et qu’ainsi on puisse co-immunoprécipiter l’ARN U2 avec la RNAPII.
Dans les cellules non synchronisées, la RNAPII transcrit et la majeure partie des transcrits su-bissent un épissage cotranscriptionnel. Dans ces conditions, on s’attend à immunoprécipiter les snARNs de l’épissage se trouvant dans le voisinage immédiat de la RNAPII en cours de transcrip-tion. Sur des immunoprécipitations RNAPII, on obtient en moyenne 11% d’ARN U1 et 7% d’ARN U2 associés à moins d’un quart de RNAPII immunoprécipitée (figure 5.4 B et C), soit environ 40% d’ARN U1 et 25% d’ARN U2 totaux associés à la RNAPII cellulaire. Les différences entre les quantités immunoprécipitées sur une RNAPII transcriptionnellement active et inactive sont plu-tôt faibles (de l’ordre de 2) et peu significatives. Si on prend cependant uniquement les expériences faites avec l’anticorps 8WG16 commercial, ces écarts sont plus prononcés et globalement on peut dire qu’il existe une interaction plus fréquente entre les ARNs de l’épissage et la RNAPII transcrip-tionnellement active.
Les Northerns blots nous ont donné des quantifications approximatives de l’ARN U1 associé à la RNAPII. Nous avions cherché dans un premier temps à être plus précis en purifiant les ARNs immunoprécipités et en amplifiant les snARNs par RT-PCR et PCR quantitative. Les nombreuses tentatives sont restées infructueuses du fait de la non-reproductibilité des résultats.
Les résultats ci-dessus démontrent l’interaction spécifique de l’ARN U1 avec la RNAPII dans des cellules mitotiques. Deux anticorps ont été utilisés dans ces expériences, l’un anti-NTerminal, l’autre anti-CTerminal de la sous-unité Rpb1. Pour essayer de déterminer si U1 s’associait pré-férentiellement à la forme hyperphosphorylée IIO ou la forme hypophosphorylée IIA, plusieurs anticorps ont été utilisés.
5.2 Autres anticorps anti-RNAPII
L’immunoprécipitation de la RNAPII sur cellules mitotiques a été réalisée avec plusieurs anti-corps différents tous dirigés contre la sous-unité Rpb1. Les premières immunoprécipitations ont été réalisées avec l’anticorps polyclonal N20 reconnaissant le domaine N-terminal de Rpb1 et ont permis de trouver U1 associé à la RNAPII. Par la suite, les autres lots de cet anticorps commercial
n’ont plus sensiblement enrichi l’ARN U1 par rapport à une immunoprécipitation contrôle (don-née non présentée). L’autre anticorps anti-RNAPII, enrichissant très nettement l’ARN U1 par rap-port au contrôle, est l’anticorps 8WG16. Celui-ci reconnaît le peptide YSPTSPS non phosphorylé du CTD. Or, la RNAPII n’est jamais complètement phosphorylée ou déphosphorylée. Il permet donc d’observer et d’immunoprécipiter les deux formes IIOet IIAde la RNAPII (figure 5.5, piste 4). Pour autant, il immunoprécipite plutôt la forme IIAque la forme IIO. Les autres anticorps anti-RNAPII utilisés immunoprécipitant correctement la RNAPII enrichissent faiblement l’ARN U1 (entre 5 et 10%) (figure 5.5). On notera cependant que les anticorps H14 et H5, bien qu’immunoprécipitant moins de RNAPII, donnent un signal U1 comparable aux autres anticorps (pistes 5 et 6). Cette tendance a été observée dans 50% des expériences. Les anticorps H5 et H14 reconnaissent les heptapeptides phosphorylés enSe r2 etSe r5respectivement. L’efficacité d’immunoprécipitation de ces anticorps n’est pas très bonne, de ce fait les résultats en Northern blot sont variables. Un autre anti-CTD, l’anticorps 4H8 immunoprécipite très bien la RNAPII (piste 7). Bien qu’étant un anti-CTD, cet anticorps reconnaît les deux formes de la RNAPII. Cependant, il n’enrichit pas l’ARN U1. De même, d’autres anticorps anti-NTerminaux (pistes 1, 2 et 3) ne co-immunoprécipitent pas largement l’ARN U1 avec la RNAPII. D’un côté, nous avons donc l’ARN U1 co-immunoprécipité avec des anticorps anti-CTD (8WG16, et dans une certaine mesure par H5 et H14) aux propriétés contraires. Ces résultats sont en accord avec les précédents travaux de Kameoka. Des immunopré-cipitations sont réalisés avec les anticorps N20, 8WG16, H5 et H14 sur des extraits nucléaires[137]. Toutes les quatre co- immunoprécipitent U1 mais 8WG16 est celui qui est le plus spécifique de cet ARN : il l’enrichit plus et les autres anticorps immunoprécipitent aussi les autres snARNs. De l’autre côté, ce même ARN U1 est également co-immunoprécipité par un anticorps anti-NTerminal (N20). Pourquoi un seul lot de N20 a-t-il permis d’enrichir U1 ? Probablement à cause de sa poly-clonalité. La distribution des anticorps au sein du lot est différente à chaque nouveau lot et mal-heureusement pour nous, la distribution « gagnante » ne s’est réalisée qu’une seule fois. A ces anticorps anti-NTerminaux, il faut rajouter le cas à part du 4H8 qui est un anti-CTD mais qui re-connaît les deux formes. Au vu des résultats 8WG16, H5, H14 d’une part et 4H8 d’autre part, cette co-immunoprécipitation ne semble pas être en lien directe avec la phosphorylation du CTD de la RNAPII. Pourtant, il serait précipité de laisser cette hypothèse car ces résultats ne reposent que sur
5.2. Autres anticorps anti-RNAPII 111
un type d’expérience qu’est l’immunoprécipitation et une type de visualisation de la RNAPII qui est le Western blot. Outre les efficacités des anticorps, les interprétations sont restreintes par les limites techniques du Western blot. Le poids moléculaire de la sous-unité Rpb1 variant de 220 à 240 kDa en fonction de sa phosphorylation, son transfert total sur membrane est délicat et l’effi-cacité difficile à estimer. D’autre part, l’article de Kameoka examine des conditions particulières dans lesquelles elle trouve un complexe formé, entre autres, de RNAPII et de la snRNP U1. Une séquence 5’ss photoactivable est utilisée pour assembler le splicéosomein vitroavec des extraits nucléaires. Les complexes formés autour de cette séquence contiennent de nombreux facteurs du splicéosome (dont la snRNP U1) ainsi que de la transcription (dont la RNAPIIO). Les anticorps N20, H14 et H5 immunoprécipitent fortement ces complexes alors que l’anticorps 8WG16 très peu.
Pourtant, dans un extrait nucléaire, 8WG16 co-immunoprécipite beaucoup d’ARN U1 et de façon spécifique. Il semble donc exister différentes associations entre l’ARN U1 et la RNAPII. Celles-ci pourraient avoir des rôles différents en fonction de l’état de phosphorylation du CTD.
Sur ces immunoprécipitations, on peut voir également la présence de l’ARN U2 et de l’ARN U5 (données non présentées). Par rapport à d’autres données obtenues auparavant, on peut dire que la présence de l’ARN U2 est de l’ordre du bruit de fond. La présence de l’ARN U5 sur des immu-noprécipitations RNAPII (et pas sur les contrôles) a déjà été observée dans des expériences précé-dentes (données non présentées) sans que l’on sache si elle a une réelle signification biologique.
L’expérience doit être menée à nouveau avec un anticorps contrôle.
H224 A10 N20 8WG16 H14 H5 4H8 1/2 1/4
IIO IIA
N-terminal C-terminal
U1
4 10 8 86 5 3 8 % 1 2 3 4 5 6 7 8 9
input
U170k
U1A
U1C
p62
cdk7/
CyclineH
FIGURE5.5 –Immunoprécipitation de la RNAPII par différents anticorps.Les