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Transesterification

Dans le document The DART-Europe E-theses Portal (Page 42-46)

en gris et le snARN U6 en vert. Représentation de l’attaque nucléophile par le point de branche-ment sur le site 5’ss par laquelle va être générée la première liaison phospho di-ester. En jaune, le groupe hydroxyle de l’exon en 5’ généré après la première réaction.

Après la première transestérification , le groupe hydroxyle de l’exon en 5’ (en orange sur le schéma) se trouve physiquement à côté de la liaison phospho-diester 2’-5’. Pour pouvoir effec-tuer la deuxième transestérification, ce groupe hydroxyle doit être positionné à proximité du site accepteur (en bleu sur le schéma) afin de pouvoir l’attaquer. Un ensemble de travaux mettent en évidence que le lasso généré après la première réaction est libéré du site catalytique afin que le 3’ss puisse y rentrer[290]. Au cours de ces réactions de nombreux facteurs d’épissage inter-viennent, ce qui explique pourquoi on trouve autant de composants lors des purifications de com-plexes[311, 355, 52]. Parmi ces protéines, une semble jouer un rôle à part entière : Prp8. D’une part Prp8 régulerait l’activité de Brr2p et de Prp28p[163], d’autre part on le trouve accroché aux snARNs U5 et U6 dans le cœur catalytique ainsi qu’aux trois sites essentiels de l’ARN : le site donneur, le site accepteur et le point de branchement[285, 35, 109, 262].

Fin de l’épissage, recyclage des composants

La libération de l’ARNm mature, le désassemblage du splicéosome et son recyclage vont im-pliqués de nouveaux réarrangements ARN/ARN et ARN/protéine. Des protéines ont été identi-fiées pour jouer un rôle dans ce recyclage. Prp24 dont l’orthologue humain est p110, permet la ré-hybridation des ARNs U4 et U6[254, 19]. Prp43 catalyse la dissociation de l’intron en lasso et le désassemblage simultané du splicéosome[7]. Il est pour cela aidé de deux autres protéines Ntr1/Ntr2[299, 308]. Des protéines ayant déjà participé aux réactions pourraient aussi jouer un rôle dans le recyclage comme le complexe Prp19 [49]. Les protéines impliquées dans les réar-rangements, les réactions catalytiques et le recyclage sont principalement des ATPases à boîte DExD/H[239]. En attendant d’être réutilisés, les facteurs d’épissage vont dans les speckles. Les speckles sont des structures nucléaires visualisés par microscopie photonique en utilisant des anticorps dirigés contre des facteurs d’épissage,notamment SC35. Il y a environ de 25 à 50 spe-ckles observés par noyau en interphase [172]. Les speckles changent lorsque l’on bloque l’épis-sage[235, 209]. Ces structures comprennent à la fois des granules de stockage des facteurs d’épis-sage (Interchromatin Granule Cluster ou IGC) et des zones d’activité d’épisd’épis-sage autour ds ARNs naissants (périfibrilles) . Néanmoins, des simulations montrent que les facteurs d’épissage n’y ré-sident pas longtemps, ils y rentrent et en sortent selon un mode Brownien[261].

1.2.4 Les UsnRNP Suprasplicéosome

Le détail de leur biogenèse est décrit dans la troisième partie. On peut retenir que ce sont des ARNs transcrits par la RNAPII, sauf U6 qui est transcrit par la RNAPIII. Après leur synthèse, ils sont exportés dans le cytoplasme pour y subir des modifications et une fois revenus dans le noyau, ils vont dans les Cajal bodies pour y être modifiés par de petits ARNs (scaARNs, small Cajal bodies RNAs). Les Cajal Bodies peuvent être aussi le lieu de super-assemblages de UsnRNP. En effet, des arguments montrent que le processus d’assemblage du splicéosome étape par étape cité ci-dessus n’est pas la réalité mais plutôt un artefactin vitro. Des penta-snRNP ou supraspliceosomes ont ainsi été mises en évidence[226, 294, 195, 11]. Un supra-splicéosome est composé de quatre

spli-1.2. Epissage 31

céosomes sur un ARNm. Cette structure a été isoléein vivoet la contradiction entre les deux mo-dèles pourrait s’expliquer par le fait qu’in vitro, l’assemblage se fait sur un ARNm déjà transcrit et non en cours de transcription comme dans la cellule. Le modèle controversé du suprasplicéosome permet aussi de donner une réponse à l’énigme des ARNm multiexoniques. Quatre nucléosomes feraient l’épissage en même temps. De plus, les réarrangements nécessaires seraient moins nom-breux et moins importants[292].

Composition des UsnRNP

UsnRNP U1 snRNP U2 snRNP U4 snRNP U5 snRNP U6 snRNP

snARN U1 U2 U4 U5 U6

protéines pécifiques U1A/Mud1 U2-A’/Lea1 15,5kD/Snu13 Prp8 cf. U4 U1C/Yhc1 U2-B”/Msl1 HPRP3/Prp3 U5-200kD/Brr2

U1 70k/Snp1 SF3a60/Prp9 HPRP4/Prp4 U5-116kD/Snu114 SF3a66/Prp11 RY-1 U5-102kD/Prp6 SF3a120/Prp21 USA-Cyp/Cpr1 U5-100kD/Prp28

SF3b49/Hsh49 U5-40kD

SF3b145/Cus1 U5-15kD/Dib1 SF3b130/Rse1

SF3b155/Hsh155 p14/Snu17

TABLE1.3 –Les protéines spécifiques des UsnRNPs chez l’homme et la levure.Sont décrites les 5 UsnRNP des eucaryotes. Les noms correspondent aux noms chez l’homme suivis du nom chez la levure. Les snRNP U4 et U6 formant un complexe, les protéines spécifiques sont communes[34, 134, 242].

1.2.5 Définition de l’exon, éléments régulateurs de l’épissage et épissage alternatif

Les exons chez les mammifères sont plutôt courts (50-250bp, la moyenne étant autour de 150pb) alors que les introns sont très longs (la moyenne est de 3365 pb, certains font plus de 10kb)[173]et représentent plus de 90% des transcrits[325]. Les premières expériences ont démon-tré que la mutation d’un site d’épissage (figure 1.11 A) entraînait l’exclusion de l’exon. Il a alors été

supposé que l’épissage reposait sur une « définition par l’exon » : il existe une interaction initiale et une stabilisation à travers l’exon des facteurs liés au 3’ss et au 5’ss avant la formation d’interactions à travers l’intron[200]. Une représentation schématique de la définition de l’exon est présentée dans la figure 1.10 A. Ce système est retrouvé chez les mammifères. Il s’oppose à la « définition par l’intron » plus commune chez les invertébrés, les plantes et les champignons[337], également schématisé dans la figure 1.10 A. L’une ou l’autre de ces définitions est le résultat du croisement d’informations portées par des séquences régulatrices de l’épissage (SRE). Ces séquences se dis-tinguent en 2 groupes en fonction de leur localisation (figure 1.10 B) : ESE et ESS (exonic spli-cing enhancer/silencer) séquences contenues dans l’exon et stimulant ou inhibant l’inclusion de l’exon ; ISE et ISS (intronic splicing enhancer/silencer) séquences contenues dans l’intron et sti-mulant ou inhibant l’usage des sites d’épissage adjacents[325].

1.2. Epissage 33

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