L’ARN Alu

L’ARN Alu serait l’homologue humain de l’ARN B2. Les gènes Alu sont les SINEs les plus repré-sentés. On en compte plus d’un million de copies, ce qui représente plus de 10% du génome. Ils sont plutôt présents dans les gènes codant pour des protéines, le plus souvent dans les régions in-troniques. L’ARN Alu est composé de 2 bras similaires mais distincts, le bras gauche et le bras droit, réunis par une chaîne riche en adénine et se termine par une queue poly(A). Les deux bras se dif-férencient par deux séquences : une séquence de 31 pb présente sur le bras droit et un promoteur interne pour la RNAPIII sur le bras gauche. Les gènes Alus ne sont exprimés qu’en cas de stress.

Lors d’un choc thermique les ARNs Alu sont donc abondamment exprimés. L’équipe de Kugel et Goodrich a mis en évidence la restauration de la transcription de gènes éteints par le choc ther-mique grâce à l’inhibition de cet ARN par antisens (ADNc clone TS 103, connu pour être exprimé sous la forme d’un transcrit de 281 nucléotides dans les cellules humaines[278]). In vitro, cet ARN s’associe à la RNAPII et un ARN Alu pourrait se fixer à deux molécules de RNAPII. Les deux bras de cet ARN sont deux longues tiges-boucles séparées par une région non structurée. Cette dernière région et une région située sur la deuxième boucle semblent suffisantes pour l’inhibition de la transcription indépendamment l’une de l’autre. Comme l’ARN B2, l’ARN Alu s’associe à la RNAPII pendant la formation du PIC. Cette RNAPII en complexe avec B2 ou avec Alu est bloquée sur les promoteurs des gènes dont l’expression est réprimée[198].

Chapitre 4

Objectifs

Le laboratoire d’Olivier Bensaude travaille sur les ARNs non codants. Mon sujet de master a pris comme point de départ les travaux sur l’ARN 6S chez la bactérie et sur l’ARN B2 chez la souris.

Ces ARNs non codants n’ont rien en commun d’un point de vue de la séquence mais possèdent plusieurs caractéristiques en commun. Ils sont tous deux exprimés lors d’un stress. L’ARN 6S est transcrit lorsque les bactéries arrivent en phase stationnaire et l’ARN B2 est produit par les cel-lules murines à la suite d’un choc thermique. Tous deux sont abondamment exprimés dans ces situations et sont responsables d’une inhibition de la transcription dans ces cellules. Cette inhi-bition est la conséquence de leur liaison à l’ARN polymérase. L’ARN 6S se fixe dans la crevasse de la RNAP, bloquant l’accès au promoteur. L’ARN B2 inhibe la RNAPII avant la formation du PIC, potentiellement par un mécanisme similaire. Ces deux exemples d’ARN inhibiteurs de la RNAPII nous ont poussés à chercher des ARNs non codants, associés à la RNAPII humaine en-dehors de tout contexte de stress.

L’objectif étant de répondre à une question la plus ouverte qui soit, il fallait avoir accès à toutes les formes de RNAPII, à savoir phosphorylée ou non. Pour réaliser cela, je suis partie de cellules HeLa, particulièrement résistantes au traitement nocodazole (85 % d’entre elles sont viables après 16-18h de traitement). En effet, en mitose, la RNAPII est détachée de l’ADN et donc facilement extractible sans avoir besoin d’utiliser des conditions trop dénaturantes qui casseraient les liai-sons potentielles avec des partenaires ARNs. Les ARNs obtenus de cette façon ont été purifiés et marqués radioactivement. Parmi ces ARNs, le snARN U1 a été identifié.

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La co-immunoprécipitation de l’ARN U1 avec une RNAPII non transcriptionnellement active a orienté la suite de mon projet sur la recherche du rôle de cette association et par conséquent à d’abord la caractériser. Nous avons cherché à déterminer si cette interaction était spécifique de l’ARN U1, des ARNs de l’épissage ou bien d’un ARN abondant en cherchant la présence de l’ARN U2 et de l’ARN 7SK. En cherchant biochimiquement quels étaient les partenaires associés, nous nous sommes rendus compte que la snRNP U1 était entièrement et spécifiquement associée à la RNAPII non transcriptionnellement active. Afin de savoir si cette liaison avait un lien avec l’épis-sage, j’ai créé deux lignées cellulaires comportant le même gène en multiples copies mais distinct entre les deux lignées par sa propriété à être épissé ou non. Ces copies sont insérées à un endroit unique du génome. Par microscopie à fluorescence et analyse d’images, j’ai ensuite observé l’en-richissement des snARNs de l’épissage sur ce macro-site de transcription. Alors que les ARNs U2, U4, U5 et U6 ne sont plus enrichis sur un site dont l’ARNm n’est pas épissé, le snARN U1 est recruté d’une façon similaire dans les deux cas. Les protéines de la snRNP U1 sont également présentes sur le macro-site de l’ARNm non épissé. Cet enrichissement de la snRNP U1 indépendamment de l’épissage a peut-être pour vocation de préparer l’épissage. Dans cette hypothèse, plusieurs pro-téines ont été testées pour voir si elles étaient toujours présentes avec la snRNP U1 : des propro-téines SR directement impliquées dans l’épissage ou associées à des granules de stockage des facteurs d’épissage (speckles). Les résultats montrent que la snRNP U1 est recrutée sans autres protéines impliquées dans les premières étapes de l’épissage et que cet enrichissement est indépendant des speckles. Le profil de protéines co-enrichies avec la snRNP U1 sur un gène dont l’ARNm n’est pas épissé semble donc précis et reflète probablement le rôle de ce recrutement.

La suite de ce manuscrit va présenter les résultats énoncés ci-dessus.

Deuxième partie

Matériels et méthodes

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4.1. Analyse radiale 77

4.1 Analyse radiale

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