ont été analysées en FISH U2. 136 cellules WT et 157 cellules MUT ont été analysées en FISH U4.
167 cellules WT et 127 cellules MUT ont été analysées en FISH U4, U5 et U6.
6.2.2 Le snARN U2
Le snARN U2 a été observé également par FISH. Deuxième étape de l’épissage et première étape nécessitant de l’énergie, sa présence n’est possible que si la première étape engagée par U1 est réalisée. U2 est effectivement bien recruté sur un site de transcription épissé (figure 6.6). Son enrichissement au site est comparable à celui de U1. En revanche, le snARN U2 n’est pas plus en-richi au site de transcription que sur un site contrôle nucléaire. Le FISH U2 étant réalisé avec une seule sonde, cet écart pourrait s’avérer plus grand en réalité (cf l’explication donnée pour U4) et U2 pourrait être également sous-représenté sur un site de transcription non épissé. Cette absence d’enrichissement n’est pas due à une mutation du point de branchement, la mutation ayant per-mis de mettre l’intron dans la phase ouverte de lecture se trouvant bien en amont. Quoi qu’il en soit, ni U2, ni U4, ni U5, ni U6 ne sont enrichis sur un site de transcription non épissé, ils pourraient même y être sous-représentés par rapport à un autre endroit du noyau, en-dehors des nucléoles.
6.2.3 Le snARN U1
Sur un site de transcription qui épisse, l’ARN U1 est enrichi par rapport à un site contrôle dans le noyau. Etant donné que tous les autres snARNs y sont présents, ce résultat semble aller de soi.
Mais contrairement à tous les autres UsnARNs de l’épissage, l’ARN U1 est toujours enrichi sur un site de transcription qui n’épisse pas. Cet enrichissement est d’autant plus surprenant qu’il est comparable à celui observé sur la lignée WT. Cette expérience a été menée plusieurs fois et l’enri-chissement a toujours été observé sur les deux lignées. Parfois, on a observé un peu moins d’en-richissement dans la lignée MUT. La dynamique des images ne semble pas être le problème car elle a une grande amplitude et ce, pour deux raisons : deux sondes sont dirigées contre le snARN U1 et celui-ci est le plus abondant de tous les snARNS (1 million de copies par noyau[358]). La présence de l’ARN U1 au site de transcription rejoint l’observation donnée par les résultats bio-chimiques, à savoir U1 est associé à l’ARN polymérase II transcriptionnellement inactive. Cette présence au site n’est pas due à la persistance de l’hybridation de l’ARN U1 au site 5’ss. Le site 5’ss de l’intron de la construction MUT contient déjà un mésappariement par rapport à la séquence consensus en position+4 (figure 6.2 B). En rajoutant deux mutations ponctuelles sur les deux nu-cléotides principaux, on fragilise encore plus l’hybridation. Or, des travaux ont montré d’autres
6.2. Recrutement du splicéosome 129
mutations ponctuelles sur le site 5’ss qui invalident fortement la reconnaissance par U1 [169, 59]. Dans ces expériences, un mésappariement en position+3 dans la séquence du site donneur abolie complètement l’épissage par la fragilisation de l’hybridation 5’ss-U1. Les mutations des positions les plus conservées du site donneur et le mésappariement naturel de l’intron 1 de la β-globine portent au nombre de 3 les mésappariements qui déstabilisent sévèrement l’hybridation 5’ss-U1.
De plus, si l’hybridation 5‘ss muté-U1 persistait faiblement malgré tout, on s’attendrait à avoir un taux d’ARNm produits beaucoup plus important dans le cas de la lignée MUT pour maintenir un enrichissement de l’ARN U1 comparable à celui du site de transcription épissé. Or, la production d’ARNm au site de transcription est identique entre les deux lignées. La présence de l’ARN U1 sur le site de transcription non épissé ne peut donc pas provenir de la persistance d’une hybridation 5’ss muté-U1. Les résultats des différents FISH montrent que les snARNs de l’épissage sont tous recrutés sur un site de transcription épissé. Ces résultats confirment les premières données de mi-croscopie montrant l’intron rapidement dégradé à la périphérie du site. L’épissage du gène de la lignée WT est bien cotranscriptionnel. D’autre part, le splicéosome n’est pas recruté sur un gène ne nécessitant pas d’épissage. Le seul snARN toujours présent est l’ARN U1.
6.2.4 La snRNP U1
Afin de vérifier si, comme pour la biochimie, l’ARN U1 est accompagné des protéines de la U1snRNP, j’ai testé par immunofluorescence la présence des trois protéines spécifiques de la U1snRNP.
La figure 6.7 montre un enrichissement de la protéine U170k au site de transcription dans la lignée WT comme dans la lignée MUT. De même, la protéine U1A est enrichie au site qu’il y ait épissage ou pas. On observe donc un comportement identique des protéines de la snRNP U1 à celui de l’ARN U1. La snRNP U1 semble donc être recrutée au complet sur le site de transcription en ab-sence d’épissage. Pourtant, on constate une différence non négligeable d’enrichissement au site entre le site de transcription épissé et non épissé. Cela est délicat à interpréter dans la mesure où l’interaction entre l’ARN U1 et la protéine U1A est très forte (Kd≈10-9) [193]. On sait par ailleurs que toutes les protéines U1A ne sont pas en complexe avec la snRNP U1 mais qu’on les trouve aussi associées avec le facteur PSF (polypyrimidine-tract binding protein-associated factor), p54nrb et p68 sous la forme du complexe SF-A (snRNP-free U1A) [192, 183]. Ce complexe jouerait un rôle
dans la polyadénylation des ARNm. Si beaucoup de U1A est recruté sur le site de transcription épissé (dans certaines expériences le recrutement atteint 1,5 unités arbitraires), peut-être est-ce dû en partie à la snRNP et en partie au complexe SF-A. Il faudrait vérifier la présence de PSF et p54nrb sur le site de transcription non épissé.
0 500 1000 1500
1.01.11.21.31.41.5
radius in nanometer
U1A signal recruitment
0 500 1000 1500
1.01.11.21.31.4
radius in nanometer
U170k signal density
WT U170k TS WT U170k RS MUT U170k TS MUT U170k RS
U1A U170k
DAPI U1A DAPI U170k
WT
MUT