6.3 Protéines annexes
Un gène qui n’épisse pas recrute tout de même et uniquement la U1snRNP. D’autres facteurs en-dehors des UsnRNPs sont requis pour participer à l’épissage, notamment plusieurs protéines SR. SF2/ASF est une protéine que l’on retrouve dans les complexes A et B du splicéosome [70, 18]. C’est une protéine SR qui stimule la liaison de la snRNP U1 et module le choix du 5’ss. Cette acti-vité serait portée par l’interaction entre ASF/SF2 et U170k [154]. Outre ses interactions protéine-protéine, SF2/ASF a la capacité de se lier à des SRE sur l’ARN, le plus souvent des ESE mais aussi parfois des ISS [200]. Puisque SF2/ASF interagit avec U170k, j’ai regardé son enrichissement au site de transcription. Il s’avère que cette protéine est toujours présente qu’il y ait épissage ou non (figure 6.8). On voit en effet un fort recrutement au site de transcription, bien que celui-ci soit différent en fonction de la lignée cellulaire.
SF2/ASF
FIGURE 6.8 –Recrutement spécifique de certaines protéines SR au site de transcription non épissé.111 cellules WT et 88 cellues MUT ont été analysées en immunofluorescence anti-SC35.
109 cellules WT et 110 cellules MUT ont été analysées en immunofluorescence anti-SF2/ASF. 195 cellules WT et 217 cellules MUT ont été analysées en immunofluorescence anti-U2AF65.
6.3. Protéines annexes 133
La protéine SC35 (Splicing Component 35) est aussi une protéine SR impliquée dans l’épissage, faisant partie des complexes A et B du splicéosome[70, 18]. Comme ASF/SF2, SC35 se lie à des ESE pour favoriser l’inclusion des exons lors de l’épissage. D’autre part, SC35 est un composant des speckles, ces structures de stockage de composants d’épissage [172]. L’analyse a été réalisée sous un mode un peu différent puisque le signal SC35 forme des foci (les speckles) et entre ces foci, des zones où il n’y a pas de signal. J’ai donc choisi deux contrôles, un absolument négatif et un autre ab-solument positif pour le signal SC35. On constate de cette façon que la protéine SC35 est recrutée au site de transcription épissé. Le contrôle positif représentant 100% de speckles et le négatif 0%, cet enrichissement en SC35 au site signifie que le site de transcription épissé est souvent mais pas toujours associé à un speckle. En revanche, le site de transcription non épissé n’accumule aucun signal SC35. Ce site n’est donc jamais associé à un speckle. Etonnamment, ASF/SF2 est aussi un facteur que l’on trouve associé aux speckles. Pour autant le comportement de ces deux protéines, SC35 et ASF/SF2, est différent lorsqu’il n’y a pas d’épissage. Néanmoins, si ASF/SF2 est toujours enrichi au site non épissé, il l’est dans une moindre mesure comparé à la lignée WT. Cette perte d’ASF/SF2 provient peut-être de l’absence de speckles autour du site non épissé. La protéine U2AF (U2 small nuclear ribonucleoprotein auxiliary splicing factor) n’est pas une protéine SR mais elle possède un domaine RS (Arginine-Sérine). Elle est composée de deux sous-unités de 35 et 65kDa.
U2AF65 reconnaît la séquence polypyrimidine et recrute U2snRNP au point de branchement alors que U2AF35 marque le dinucléotide AG au site accepteur [316, 212]. U2AF65 interagit avec les snRNP U1 et U2 et aussi avec le point de branchement. Il a été démontré que U2AF65 était associé avec la RNAPII dans le complexe d’initiation avant le début de la transcription [310]. Il pourrait ainsi scanner les ARNs naissants à la recherche d’une séquence polypyrimidine. La présence de U2AF65 dans ce contexte aurait pour effet de diminuer le temps de pause de la RNAPII. U2AF65 permet aussi l’export des ARNs avec ou sans introns chez la Drosophile[28]. En regardant par immunofluorescence la protéine U2AF65, on constate qu’elle est bien recrutée sur le gène épissé (figure 6.8). En revanche, U2AF65 est absent du site de transcription non épissé. Pour autant, il n’y a pas de problème d’export des ARNs non épissés. Peut-être que U2AF65 n’est pas requis pour l’export des ARNs sans introns. D’autre part, la présence de la U1snRNP sur un gène non épissé ne suffit pas à faire venir U2AF65 et la U2snRNP. La présence de U1snRNP ne semble donc pas en lien
direct avec l’épissage.
Tat-SF1 est l’homologue humain de Cus2 (U2snRNP) chez la levure. Il fait des interactions avec la snRNP U2. Chez la levure, il est indispensable pour les réarrangements de l’ARN U2 fixé au point de branchement qui doit se déplier et se replier pour créer le site catalytique. Nous avons donc voulu regarder si Tat-SF1 était recruté au site de transcription avec ou sans intron pour voir s’il pouvait être présent avec la snRNP U1 pour faire venir la snRNP U2. Comme nous ne dispo-sions pas d’anticorps performants en immunofluorescence, nous avons transfecté le plasmide co-dant pour la protéine Tat-SF1-FLAG. La figure 6.9 montre les résultats d’une immunofluorescence contre l’étiquette FLAG dans les lignées MUT ou WT. Tout d’abord l’expression est variable d’une cellule à l’autre du fait de la transfection qui n’est pas homogène. Les images ont été à chaque fois prises sur des cellules exprimant un taux de protéines transfectées au moins 4 fois supérieur au bruit de fond. Sur ces images, le recrutement est significatif quoique plutôt faible au site de trans-cription, quelle que soit la lignée. Il semble donc qu’il y ait du TAT-SF1 en faible quantité sur les sites de transcription, indépendamment ou non de l’épissage. Ces résultats doivent tout de même être pris avec précaution car ils reflètent uniquement le comportement de la protéine transfectée et donc surexprimée.