4.1 Les tripodes faciaux
4.1.1 Résultats
Les courbes SAXS des différents tripodes en fonction de leurs concentrations (figure
2.22) montrent deux comportements différents. D’un côté le C3Glu3 et le C4Glu3 pré- sentent des courbes décroissantes monotones, dont le profil évolue en fonction de la concen- tration, et qui ont la particularité de se croiser en un point unique, à des valeurs intermé- diaires de q. De l’autre côté le C5Glu3 montre un comportement plus "classique" avec des
courbes superposables, dans la majorité du domaine angulaire, et la présence d’un second maximum entre 2 et 3 nm−1, zone qui correspond à la structure générale de la micelle en
solution (le premier maximum est obtenu à q=0 nm−1).
Figure 2.22 – Courbes SAXS du C3Glu3 (A), C4Glu3 (B) et C5Glu3 (C) en fonction de la concentration. Les courbes de Guinier sont données dans les inserts.
Les C3- et C4Glu3 La présence d’un point d’intersection unique des courbes SAXS
est généralement caractéristique d’un équilibre entre deux espèces en solution : l’une pré- dominante à faible concentration, et l’autre majoritaire aux fortes concentrations. Il faut bien noter que dans ce cas, l’analyse SAXS ne permet que d’analyser une population moyenne, qui ne représente pas tout à fait la réalité puisque les solutions sont alors poly- disperses. L’approximation du Guinier des C3- et C4Glu3 a donc été réalisée pour chaque concentration afin de déterminer, la masse, le rayon de giration et le nombre d’agrégation de l’agrégat "moyen" à chaque concentration. La plus faible concentration (respectivement 2,4 et 2,6 mg/mL) donne le signal d’un monomère pour le C3Glu3, et celui d’un dimère pour le C4Glu3. L’approximation du Guinier pour les concentrations supérieures montre que lors de l’ajout de tensioactifs les agrégats en solution grossissent avec la concentration, et le fait que les courbes SAXS ne soient pas superposables indique un changement net de leur forme générale. Aux plus fortes concentrations testées le C3Glu3 (44 mg/mL) est sous forme d’un trimère et le C4Glu3 (42mg/mL) sous forme d’heptamère. En calculant
mathématiquement les courbes SAXS données pour des équilibres entre un monomère et un trimère de C3Glu3 et entre un dimère et un heptamère de C4Glu3, on s’aperçoit que les courbes se superposent parfaitement aux courbes SAXS expérimentales, confirmant la probable présence d’un équilibre entre une forme monomérique et trimérique pour le C3Glu3, et dimérique (ou monomérique) et heptamérique pour le C4Glu3. Des courbes à plus fortes concentrations auraient peut être permis de voir une stabilisation du signal avec l’obtention d’une forme finale.
Le C5Glu3 Le composé C5Glu5 présente un comportement micellaire moins atypique,
puisque les courbes SAXS présentent toutes la même allure, et se superposent sur la majorité du domaine des q. A la plus faible concentration (2,51 g/L), le signal enregistré lorsque q tend vers zero reste croissant, et ne tend pas vers l’horizontal, ce qui plaide en faveur d’une micelle allongée. Pour vérifier cette tendance, nous avons tracé la fonction de distribution de paire du C5Glu3 à trois concentrations (figure2.23). Elle met en évidence une évolution de la taille de cet agrégat en fonction de la concentration en tensioactif. A 5,6 g/L sa longueur maximale est de 11 nm alors qu’elle est deux fois plus grande à 42 g/L. De tels profils de la fonction de distribution de paire P(r), sont en général obtenus en présence d’objets allongés, c’est pourquoi nous avons tracé q.I(q) en fonction de q2
(figure2.24). L’obtention d’une relation linéaire entre q.I(q) et exp(q2), confirme l’aspect
cylindrique (en forme de bâtonnets) de ces micelles.
Figure 2.23 – fonction de distribution de pair du C5Glu3 à différentes concentrations
Les équations des courbes de tendance obtenues sur la figure 2.24 permettent de cal- culer le rayon du cylindre. Par ailleurs, en réalisant l’approximation du Guinier, le rayon de giration permet d’estimer la longueur du cylindre (L) selon L= √12.RG, l’intensité diffusée à l’origine donne la masse (Mw) et le nombre d’agrégation (Nagg) de la micelle. Ces valeurs caractéristiques de la micelle de C5Glu3 sont répertoriées dans le tableau
Figure 2.24 – q.I(q)=f(g2) pour le C5Glu3. L’existence d’une relation de type exponentielle
entre ces deux valeurs est caractéristique d’objets allongés de type cylindrique en solution
2.9. Ainsi il est possible de voir que la micelle cylindrique du C5Glu3 s’allonge lorsque la concentration en tensioactif augmente mais que son rayon n’évolue pas. L’évolution de la masse et de la longueur de la micelle varie linéairement avec la concentration en tensio- actif, sans atteindre de plateau à la plus forte concentration testée. Il est donc possible qu’à des concentrations supérieures, la micelle de C5Glu3 continue de grossir.
Conc (g/L) Rg (nm) L (nm) Rc (nm) I(0) (u. a.) Mw (kDa) Nagg
2,81 3,61 12.5 1,45 13426 16,244 13
5,60 3,76 13 1,48 15997 19,355 16
11,20 4,19 14.5 1,52 20659 24,995 20
22,50 4,85 16.8 1,49 26822 32,452 27
42,00 5,67 19.6 1,49 37617 45,513 38
Tableau 2.9 – Caractéristiques de la micelle de C5Glu3 en fonction de la concentra- tion
4.1.2 Conclusion
Les tripodes à chaînes courtes à trois carbones présentent une hydrophobie trop faible pour que les molécules puissent correctement s’associer entre elles sous forme de mi- celles. L’observation de la structure 3D du C3Glu3 donnée par Chemdraw (figure 2.25), laisse penser que ces chaînes très courtes ont peut être des difficultés à créer des interac- tions latérales. Seules des interactions ponctuelles au niveau des extrémités des chaînes
se créeraient, limitant ainsi le nombre d’agrégation du C3Glu3. La formation de ces agré- gats composés de 2 ou 3 unités est thermodynamiquement favorable puisqu’elle permet d’éviter le contact entre l’eau et la face hydrophobe de l’amphiphile. Une concentration d’agrégation critique est donc mesurable en tensiométrie de surface, mais les agrégats sont à peine plus gros que le monomère. C’est probablement pour cela que le signal SAXS présente un point d’intersection des courbes aux différentes concentrations, témoin d’un possible équilibre entre deux espèces.
Figure 2.25 – Structure 3D du C3Glu3
L’augmentation du nombre de carbones augmente le caractère hydrophobe des tripodes comme en atteste l’abaissement des concentrations d’agrégation critique pour le C4Glu3 et C5Glu3. Les interactions hydrophobes sont facilitées et l’on observe une augmentation du nombre d’agrégation. Les interactions ne se feraient plus uniquement par l’extrémité des chaînes, mais aussi latéralement. Plusieurs molécules de tensioactif peuvent se retrouver "côte à côte" pour limiter aussi l’exposition à l’eau de la surface hydrophobe latérale. Toutefois avec le C4Glu3, les agrégats restent petits, la chaîne ne semble pas suffisamment longue pour optimiser les interactions, et avoir un agrégat dont la géométrie est bien définie. Une chaîne à cinq carbones semble être le minimum pour obtenir des interactions suffisamment importantes pour générer des agrégats de forme définie, avec un nombre d’agrégation plus important (Nagg=13 à 15 fois la concentration d’agrégation critique) que l’on peut considérer comme des micelles. Il est intéressant de remarquer que pour les tensioactifs à tête sucre, il est d’usage de considérer que la chaîne alkyle doit comporter au moins 6 ou 7 carbones, pour observer un comportement tensioactif. Finalement ce rapport est à peu près respecté dans les tripodes, puisque pour trois têtes glucose, il faut trois chaînes comportant au moins cinq carbones. Toutefois la grande différence se joue au niveau du paramètre de packing puisque dès le C5Glu3, les micelles obtenues sont cylindriques avec l’inconvénient d’avoir une taille qui évolue avec la concentration en tensioactif. Or pour obtenir des micelles stables il faut tendre vers des micelles sphériques, et donc faire varier le paramètre de packing.
La géométrie particulière des tripodes permettait d’envisager que leur paramètre de packing puisse évoluer en allongeant les longueurs de chaîne. En effet pour une seule chaîne aliphatique, le rapport V/L reste constant (0,21 nm2) quelque soit le nombre de
chaînes parallèles. Des tripodes en C6, C7 et C8 ont été synthétisés par Julien Dauvergne pour augmenter les surfaces d’interaction hydrophobes, mais ces composés ont montré des solubilités faibles, qui limitent leur usage comme tensioactif. Une voie d’optimisation de ces amphiphiles faciaux seraient donc de travailler sur leur tête polaire avec deux objectifs majeurs : (i) améliorer la solubilité des ces composés, et pouvoir ainsi avoir une plus grande souplesse quant à la longueur des chaîne alkyles et (ii) diminuer le paramètre de packing, en augmentant la section de la tête, afin d’obtenir des micelles de type ellipsoïdale, plutôt que cylindrique, qui risquent moins d’évoluer avec la concentration en tensioactif.
4.2 Le F
8TAC
4.2.1 Facteur de forme
Figure 2.26 – Profils de diffusion du F8TAC en tampon Tris/HCl 20 mM pH8
La figure 2.26 présente l’intensité des rayons X aux petits angles diffusée par des solutions de F8TAC dans un tampon Tris/HCl 20 mM pH8. Les profils de diffusion du
F8TAC sont décroissants sur tout le domaine des q, et sont relativement "plats" au niveau
du domaine angulaire correspondant au facteur de forme de la micelle (1,5-2,5 nm−1).
L’absence de second maximum peut être le signe que l’objet présente une forme allongée plutôt que globulaire, et/ou que l’objet possède une homogénéité de contraste électronique. Nous verrons figure2.27, que le tracé de la fonction de distribution des distances de paires confirme l’aspect globulaire de la micelle de F8TAC, et permet d’attribuer l’origine de
l’absence de second maximum dans le profil de diffusion, à la densité électronique de ce composé.
En absence de second maximum, le signal diffusé pour q compris entre 1,5 et 2,5 nm−1 est tellement faible par rapport à celui du solvant, que les courbes ne s’ajustent
pas exactement aux grands angles. Toutefois elles se superposent relativement bien juste avant cette zone, pour q compris entre 0,5 et 1,5 nm−1, ce qui indique que la micelle
est bien stable en solution, sa forme et sa taille ne dépendent pas de la concentration en F8TAC. Aux très petits angles, lorsque q tend vers 0, il apparaît que l’intensité diffusée
diminue lorsque la concentration en tensioactif diminue, ce qui est caractéristique de micelles exerçant entre elles des forces répulsives comme nous le verrons lors de l’étude des interactions.
Figure 2.27 – Fonction de distribution de pair du F8TAC
La fonction de distribution des distances du F8TAC, donnée dans la figure2.27, montre
que la longueur maximale de la micelle est de 8,2 nm. La p(r) présente un seul pic, relativement symétrique ce qui indique d’une part que la micelle de F8TAC possède une
forme globulaire (sphère ou une ellipsoïde), et d’autre part que sa densité électronique est homogène. Le contraste électronique entre le cœur hydrophobe de la micelle et sa partie polaire constituée de têtes poly THAM apparait comme étant très faible. Cette caractéristique "l’emporte" sur la forme globulaire de la micelle lors de la diffusion des RX, puisque le profil de diffusion ne présente pas de second maximum.
La micelle de F8TAC étant homogène elle peut être modélisée par une forme globulaire
uniforme ou par un modèle ab initio. De par la polydispersité du F8TAC, imposant une
erreur sur la détermination de sa densité électronique, nous avons préféré utiliser un modèle ab initio qui ne nécessite la détermination d’aucun paramètre préalable. La forme générale de la micelle de F8TAC obtenue (figure 2.28) donne un objet de type ellipsoïdal.
Ce modèle ne permet cependant pas de déduire les dimensions de la micelle. Ceci peut être fait par l’analyse de Guinier qui donne le Rg et la masse de la micelle. Les résultats indiquent une masse de la micelle de F8TAC à environ 73 kDa, soit un nombre d’agrégation
d’un cinquantaine d’unités et un rayon de giration d’environ 2,9 nm.
Figure 2.28 – Modèle ab initio de la micelle de F8TAC par DAMMIN. Le résultat indique
une micelle de forme ellipsoïdale.
4.2.2 Facteur de structure
Afin d’étudier les interactions entre micelles, des données de SAXS ont été collectées pour des solutions de F8TAC à différentes concentrations et dans différentes conditions
de solvant : avec ou sans sel, et avec ou sans PEG. La figure 2.29 montre l’évolution du facteur de structure de ces solutions pour trois conditions (Tris, Tris + sel, et Tris + sel + PEG). Il apparaît ainsi très clairement que le facteur de structure reste toujours inférieur à 1, et évolue en fonction de la concentration de façon similaire dans les trois cas, ce qui signifie que les micelles exercent des forces de répulsion les unes par rapport aux autres. La pente de la droite donne une valeur de A2 de 0,43.10−4 mol.mL.g−2 pour la solution
de F8TAC en Tris, sans ajout d’agent précipitant (PEG, sel).
Les micelles de F8TAC présentent donc la particularité d’être répulsives entre elles
malgré la présence de 6% de PEG 3350. Dans les gammes de concentrations testées en agent cristallisant (≤100 mM pour Nacl, et ≤6% pour le PEG), il n’a pas été possible d’obtenir une régime attractif, favorable à la cristallisation.
4.2.3 Conclusion
L’intérêt du F8TAC dans le domaine des protéines membranaires n’est plus à démon-
trer [118–121]. Son principal inconvénient est sans doute la polydispersité de sa structure engendrée par son mode de synthèse (télomérisation radicalaire). Cependant par l’ana- lyse SAXS nous avons pu observer que malgré la polydispersité de ses têtes polaires, le F8TAC s’organise sous la forme de micelles ellipsoïdales oblates monodisperses, dont la
Figure 2.29 – Évolution du facteur de structure du F8TAC en tampon Tris/HCl 20 mM
pH8 (ligne continue), Tris/HCl 20 mM pH8, NaCl 100 mM (ligne en pointillés), Tris/HCl 20 mM pH8, NaCl 100 mM, PEG 3350 6% (ligne discontinue)
taille n’évolue pas en fonction de la concentration en tensioactifs. Leur masse est d’environ 73 kDa, et leur longueur maximale de 8,2 nm. Chaque micelle est donc composée d’un mélange de tensioactifs de différents DPn.
Au niveau des interactions, les micelles de F8TAC sont plus répulsives que celles du
DDM par exemple (A2=0,43.10−4 mol.mL.g−2, contre 0,28.10−4 mol.mL.g−2). Ce qui si-
gnifie d’après la corrélation A2/solubilité que le F8TAC est plus soluble que le DDM,
mais aussi qu’il aurait une meilleure capacité à solubiliser des protéines membranaires en solution concentrée. Il faut cependant faire attention à la lecture de ce résultat : un paramètre de A2 positif ne préjuge en rien de la capacité du tensioactif à éviter la dé-
naturation de la protéine, ni de sa capacité à maintenir la protéine en solution dans le temps. Nous parlons ici du fait que pour une protéine qui ne serait pas déstabilisée par le DDM et le F8TAC, la courbe de solubilité du complexe PDL serait plus haute (on
pourrait atteindre des concentrations plus fortes) dans le cas du F8TAC. Il est d’ailleurs
connu que les protéines solubilisées en F8TAC ont une tendance à agréger sur une échelle
de temps de l’ordre de la semaine, à cause de la faible interaction de la chaîne fluorée avec la partie transmembranaire de la protéine. C’est pour éviter ce phénomène d’agrégation que les HFTAC, surfactants hémifluorés, ont été mis au point [122].
oppose une forte résistance à l’effet de déplétion. Il y a deux façons d’expliquer qu’à 6% PEG les micelles de F8TAC restent répulsives :
1. Les forces de répulsion sont si importantes que deux micelles n’arrivent jamais à se rapprocher à une distance inférieure au diamètre du PEG. Or comme nous l’avons vu, c’est en dessous de cette distance critique que se crée le volume inaccessible au PEG, qui initie l’effet de déplétion par différence de pression osmotique. Dans ce cas de figure, il aurait fallu augmenter la taille du PEG pour augmenter le volume de recouvrement des zones de déplétion (équation 2.46) et donc le potentiel de déplétion, d’après l’équation 2.44.
2. Il se crée un effet de déplétion qui partitionne le PEG d’un côté et les micelles de l’autre mais le potentiel de déplétion serait trop faible pour contrebalancer totale- ment les forces de répulsion des micelles qui auraient alors tendance à se disperser dès qu’elles se rapprochent. L’équilibre entre regroupement des micelles par effet de déplétion et dispersion de celles-ci par les forces répulsives serait en faveur de la dispersion. Dans ce cas, pour obtenir un effet de déplétion et atteindre un régime attractif entre micelles, il faudrait augmenter le potentiel de déplétion, c’est à dire, d’après l’équation 2.44 augmenter la taille du PEG, et/ou augmenter la concentra- tion en PEG.
Chercher à comprendre la cause des interactions répulsives particulièrement impor- tantes pour le F8TAC est plus compliqué, car en l’état actuel des travaux il est impossible
de dire si la répulsion caractéristique de ses micelles, vient de la structure de la tête polaire et/ou de celle de la chaîne hydrophobe fluorée.
Si on essaie de mieux analyser les phénomènes mis en jeu qui pourraient intervenir sur la répulsion du F8TAC, on s’aperçoit qu’au niveau des têtes polaires, leur polydispersité
va donner un aspect beaucoup moins uniforme de la surface de la micelle. Dans le DDM par exemple tous les tensioactifs présentent une tête maltoside de configuration identique, qui vont pouvoir s’organiser de façon très ordonnée dans la micelle. A l’inverse le F8TAC
exhibe au solvant des chaînes poly-Tris plus ou moins longues, avec une organisation très aléatoire. Ceci peut avoir une influence sur (i) les forces d’hydratation, certainement non uniforme à la surface de la micelle en fonction du DPn de chaque tensioactif de la micelle ; et sur (ii) les interactions en général puisqu’il est difficile d’imaginer que les interactions soient optimales lorsque la surface de la micelle est formée de chaînes hydrophiles poly-Tris dont la conformation peut fluctuer considérablement.
L’autre caractéristique fondamentale du F8TAC est la présence d’atomes de fluor en grande quantité dans son cœur hydrophobe. Il n’est pas exclu que cela contribue à la répulsion des micelles de tensioactifs, mais il est difficile à ce stade d’estimer dans quelle mesure le fluor peut avoir une influence sur les interactions micellaires. Le groupe de Riess a montré le caractère ambigu des chaînes perfluorées au cœur de la micelle, qui seraient capables de créer des interactions plus fortes que les chaînes hydrogénées, malgré des forces de van der Walls plus faibles [139]. L’impact du fluor sur les interactions entre
micelles n’est donc pas clair à ce jour. L’étude des interactions entre micelles de H12TAC,
analogue hydrogéné du F8TAC permettrait sans doute de statuer sur ce point.
Toutefois l’analogie avec les liposomes "furtifs" qui sont rendus invisibles vis à vis du système immunitaire, grâce à leur surface greffée par des chaînes PEGylées, nous laisse penser que la répulsion entre micelles de F8TAC serait due à la nature de sa tête polaire.
Dans ces systèmes, les chaines PEGylées seraient responsables d’une répulsion stérique importante entre la surface du liposome et les protéines du complément, qui dominerait les forces d’attractions dues aux interactions hydrophobes et interactions de van der Waals. L’adsorption des protéines à la surface du liposome (phénomène d’opsonisation) est alors fortement limitée [160].