Les critères de stabilité des micelles en solution et de stabilisation des protéines mem- branaires modèles nous permettent, à ce stade, de définir en plus du DDM, les meilleurs candidats pour la cristallisation parmi les tensioactifs étudiés comme étant le PCC-malt, le F8TAC et le F2H9-malt. Malheureusement, suite aux difficultés rencontrées lors de la
synthèse des FH-malt, nous n’avons pas eu le temps d’étudier les interactions du F2H9-
Les résultats obtenus lors de l’étude des interactions du DDM par SAXS sont cohérents avec cette théorie puisque ce détergent classique de la cristallisation des protéines mem- branaires, présente des micelles qui deviennent de plus en plus attractives lors de l’ajout de PEG. Ce comportement est bien une caractéristique inhérente du détergent puisque nous avons montré avec le F8TAC, que tous les tensioactifs ne donnaient pas forcément
un régime attractif en PEG, ou du moins, pas sur les mêmes gammes de concentrations en tensioactif et/ou en agent cristallisant. Dans ces conditions, le PCC-malt qui pos- sède une évolution de ses interactions similaires au DDM, apparaît être un bon candidat pour les essais de cristallisation de protéines membranaires. A l’inverse la capacité du F8TAC à augmenter la solubilité des complexes PDL est mise en avant par ses interac-
tions répulsives en présence de PEG. De tels tensioactifs sont donc moins favorables à la cristallisation des PM. A notre connaissance, la seule référence bibliographique faisant état d’essais de cristallisation avec un composé de la famille du F8TAC (le F6TAC qui
possède deux carbones fluorés de moins) indique que ceux-ci ont été infructueux [119]. En terme d’interaction, de tels tensioactifs répulsifs pourraient toutefois être utilisés en partenariat avec un autre tensioactif, favorable lui à la cristallisation, pour permettre d’atteindre des concentrations plus fortes en protéine avant les essais de cristallisation. Une meilleure solubilisation de la protéine a l’avantage d’augmenter la sursaturation (c’est à dire de se placer dans des conditions initiales plus éloignées de la courbe de solubilité dans le diagramme de phase) avant cristallisation. Il y a alors plus de marge de manœuvre pour tomber sur les conditions de nucléation, puisque le "chemin parcouru dans le diagramme de phase" est plus grand. L’objectif serait alors de trouver un mélange de tensioactifs qui permettrait une meilleure répulsion en absence d’agent cristallisant, pour pouvoir concentrer au maximum la protéine purifiée, mais qui resterait sensible au phénomène de déplétion, pour passer en régime attractif en condition de cristallisation.
L’aspect quantitatif de la mesure du A2 permet d’aller encore plus loin dans l’analyse
en remarquant que les interactions attractives sont légèrement plus fortes dans le cas du PCC-malt que dans le cas du DDM. Ce résultat signifie que pour une protéine cristallisant en DDM, il est fortement probable qu’elle cristallise aussi en PCC-malt dans des conditions similaires (composition du tampon), mais avec des concentrations en agent cristallisant moins importantes. Nous allons donc nous appuyer sur cette hypothèse pour mener des essais de cristallisation du RC-LH1-puf X en PCC-malt. Ces essais se placent dans le cadre d’une étude biochimique détaillée dans la deuxième partie de ce manuscrit ayant pour objectif d’améliorer la qualité des cristaux du RC-LH1-puf X par l’optimisation de la bouée en tensioactif. Les deux voies envisagées sont :
– la modulation de la bouée du DDM avec lequel des cristaux à 8 Å de résolution ont déjà été obtenus
– l’échange du DDM par un tensioactif aux caractéristiques voisines.
Dès lors pour pouvoir contrôler la modification de la bouée, il est apparu indispensable de pouvoir quantifier la quantité de détergent (et/ou tensioactif, dans le cas de l’échange) liée à la protéine. Le chapitre suivant présente donc le développement d’une méthode de
Mise au point d’une méthode de dosage des tensioactifs par
HPTLC
La quantité de détergent est un paramètre très important à prendre en compte lors de la manipulation des protéines membranaires. En effet, une trop forte concentration en détergent peut causer la dénaturation de la protéine ou gêner les contacts entre pro- téines lors de la formation de cristaux [44,169,170]. A l’inverse une trop faible quantité de détergent ne permettra pas le maintien en solution de la protéine. Mais connaître exactement la concentration en détergent dans une solution de protéines est de prime abord compliquée puisqu’elle évolue au cours des étapes de purification. Ainsi lors de la réalisation de chromatographie d’affinité, ou lors de la concentration de la protéine, via des concentreurs d’ultrafiltration, la quantité de détergent est modifiée dans des pro- portions souvent inconnues. Différentes stratégies ont déjà été développées pour pouvoir déterminer la concentration en détergent et tensioactif dans les solutions de protéines membranaires comme par exemple l’utilisation de détergent radiomarqué [171], la spec- troscopie infrarouge à transformée de Fourier [172], un dispositif de mesure des angles de contact [173], un dosage des détergents glycosilés par spectrophotométrie [174,175], un dosage colorimétrique dérivé de la méthode de Bradford [176], une méthode par chroma- tographie gazeuse [177], ou une méthode par chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC en anglais) [178]. Toutefois ces différentes techniques nécessitent souvent de longs pré-traitements d’échantillons avant l’analyse, ou des volumes importants de protéine ce qui limite fortement leur utilisation. Avec nos tensioactifs dérivés du DDM, la méthode du dosage des détergents glycolsylés qui ne nécessite qu’une simple dérivation des sucres, par de l’acide sulfurique à chaud, pouvait sembler être adaptée et relativement facile à mettre en œuvre. Mais dans notre cas, nous avions deux contraintes majeures supplémentaires : (i) nous voulions réaliser des échanges de détergents et pouvoir doser indépendamment les deux tensioactifs en cas d’échange partiel et (ii) le complexe protéique RC-LH1-pufX
contient des pigments dont les spectres d’absorption spectrométrique interfèrent avec le dosage des détergents glycosilés à 490 nm.
Nous avons donc cherché à développer une nouvelle méthode avec pour objectif de mettre au point un dosage à la fois simple, pour être utilisé "en routine", performant, pour ne consommer que de faibles volumes d’échantillon, mais aussi efficace, pour obtenir des résultats significatifs et comparables d’un essai à l’autre. Nous allons dans ce chapitre exposer la démarche qui a permis d’aboutir à la mise au point d’une méthode de dosage des détergents et tensioactifs par HPTLC (High performance Thin Layer Chromatography). Après avoir déterminer la méthode de révélation la plus appropriée pour la quantification de tensioactifs sur plaque HPTLC, nous nous sommes employés à trouver la composition de la phase mobile et les conditions de migration optimales pour la séparation de deux tensioactifs qui ne varient structurellement que par leur partie hydrophobe. Enfin nous avons dû adapter le système de dépôt automatique de échantillons aux contraintes par- ticulières des solutions aqueuses de tensioactifs (dissolution de la silice, diffusion dans la plaque, présence de mousse) pour obtenir une bonne reproductibilité de cette méthode quantitative. Ces résultats ont par ailleurs fait l’objet d’un article publié dans Journal of Chromatography A [179], qui se trouve en annexe de ce manuscrit.
1 La technique HPTLC
1.1 Principe
La technique de "high performance thin layer chromatography" (HPTLC) ou chroma- tographie sur couche mince haute performance est une forme automatisée et standardisée de la CCM classiquement utilisée dans les laboratoires de chimie. Elle repose donc sur les mêmes principes chromatographiques, avec en particulier, l’utilisation d’une phase sta- tionnaire déposée sur plaque. Dans la pratique, l’échantillon est déposé sur la bas de cette plaque qui est ensuite placée dans une cuve contenant la phase mobile. Celle-ci monte à travers la phase stationnaire par capillarité, provoquant la migration de l’échantillon. Il se produit alors des équilibres d’adsorption/désorbtion entre l’échantillon et la phase sta- tionnaire avec des fréquences spécifiques pour chaque constituant de l’échantillon. Chaque espèce migre ainsi à sa propre vitesse en fonction de son affinité pour la phase mobile (so- lubilité) et la phase stationnaire (forces électrostatiques). Au final ceci se traduit par une différence de distance de migration des composés sur la plaque et donc à leur séparation qui peut être visualisée après révélation de la plaque.
L’HPTLC permet ensuite de quantifier chacune des espèces à l’aide de standards. En effet, l’automatisation des dépôts ainsi que le contrôle systématique des conditions de migration et de révélation permettent d’obtenir pour chaque espèce, des spots (ou bandes) dont l’intensité est proportionnelle à la quantité présente initialement dans le dépôt.