Le choix du complexe RC-LH1-pufX, comme modèle d’étude sur l’influence des ten- sioactifs sur la cristallisation des protéines membranaires, repose tout d’abord sur son
Figure 27 – Modèle du RC-LH1-pufX (2a) chez Rb. blasticus par une étude AFM d’après [93]. A et B : analyse brute de la surface periplasmique et isolement de complexe dimérique. C : Moyenne des images obtenus pour un complexe RC-LH1-pufX, et le modèle associé avec en rouge le RC, en orange les hétérodimères αβ formant la LH1 et en bleu les deux pufX.
Figure 28 – Modèle du RC-LH1-pufX (2b) chez Rb. sphaeroïdes d’après [94]. La zone de contact est zoomée à droite. L’enveloppe du RC est représentée en gris avec le domaine extra- membranaire du polypeptide H en gris foncé. La bactériochlorophylle est alternativement en rouge et orange, les polypetides α et β des LH1 sont respectivement en cyan et violet, les 2 polypeptides pufX en vert.
intérêt scientifique évident. Nous venons de le voir, la structure de ce complexe fait débat et seule l’obtention d’une structure à haute résolution pourra permettre de déterminer avec précision la localisation des pigments et des polypeptides pufX. Au delà de la simple connaissance de la structure de ce complexe, il s’agit d’obtenir des informations essen-
Figure 29 – Modèle du RC-LH1-puf X (3) chez Rhodobaca bogoriensis d’après [95]. Le RC est représenté avec sa sous-unité H en jaune, L en violet, et M en bleu. Pour chaque RC Les LH1 comportent 13 hétérodimères situés en périphérie (numérotés de 1 à 13) avec en vert le polypeptide α et en orange le polypeptide β. Le 14ième hétérodimère est en bleu, et les deux polypeptides pufX en rouge.
tielles sur les interactions entre ces différents éléments du complexe RC-LH1-pufX, pour comprendre les mécanismes moléculaires mis eu jeu lors de la première étape du la photo- synthèse. Ce niveau de compréhension est nécessaire pour ensuite aborder la question de l’organisation supra-moléculaire de ces complexes dans les membranes photosynthétiques. Bien sûr le choix d’un modèle si complexe est ambitieux et il aurait été envisageable de choisir un modèle plus simple comme la bactériorhodopsine, dont des cristaux, à fort pou- voir diffractant, ont déjà été obtenus par toutes les méthodes existantes. Mais justement, pour étudier la cristallogénèse et pouvoir mesurer et comparer l’influence des différents tensioactifs, nous avions besoin d’une protéine moins stable, d’une protéine qui "ne cristal- lise pas à tous les coups". Il nous fallait, au final, une protéine qui corresponde à l’immense majorité des protéines membranaires, un cas général : une protéine qui ne donne pas de cristaux permettant la détermination de sa structure. Le complexe RC-LH1-pufX en fait partie. Il est constitué comme beaucoup de protéines, de l’association de plusieurs sous- unités protéiques (les hétérodimères αβ, les différents peptides du RC) et possèdent des cofacteurs non-protéiques (les pigments, les quinones) qui vont être soumis à l’influence directe des tensioactifs. Les conditions sont donc loin d’être en faveur de la réussite de sa cristallisation, ce qui amplifie l’intérêt d’une étude sur sa cristallogénèse.
Enfin la dernière raison, et peut être la plus importante, est que nous ne partions pas, non plus, de rien. De nombreux essais de cristallisation avaient déjà été réalisés sur ce
complexe lors d’une collaboration entre E. Pebay-Peroula et C. Jungas. Des conditions de cristallisation du complexe avaient été déterminées en présence de DDM et des cristaux diffractant à 8 Å de résolution avaient pu être obtenus (Colette Jungas, communication personnelle, figure 30). Ces résultats étaient prometteurs pour essayer de mieux com- prendre l’influence des paramètres clés de la cristallisation dans le but ultime d’améliorer le pouvoir diffractant des cristaux de RC-LH1-pufX. Ils permettaient de démarrer notre étude, avec une première référence en détergent classique, et de pouvoir espérer mieux comprendre l’influence des paramètres clés de la cristallisation, pour peut être améliorer le pouvoir diffractant des cristaux de RC-LH1-pufX.
Figure 30 – Cristaux de RC-LH1-puf X de Rb. blasticus diffractant à 8 Å de résolution. Collaboration Colette Jungas et Eva Peybay-Peroula.
4 Les objectifs de l’étude
Dans ce travail, nous avons cherché à mieux comprendre l’influence des tensioactifs lors la cristallisation des protéines membranaires. Cet objectif nécessite de connaître intime- ment les tensioactifs aussi bien au niveau de leur physico-chimie que de leurs interactions avec la protéine. Nous nous sommes appuyés sur l’étude de plusieurs tensioactifs (le DDM, le F8TAC, le PCC-malt, les tripodes et les FH-malt), et d’une protéine membranaire (le
RC-LH1-puf X) et nous avons adopté une approche originale et pluridisciplinaire de la cristallisation des protéines membranaire, au cours de laquelle nous voulions :
1. Utiliser de nouveaux amphiphiles au design spécialement conçu pour répondre aux contraintes de protéines membranaires et les comparer à un détergent classique de la cristallisation des protéine membranaire : le DDM ;
2. Caractériser les assemblages de ces tensioactifs en solution ;
3. Traduire, en terme d’interaction, les différentes forces impliquées dans la cristal- logénèse en fonction des conditions de cristallisation pour rationaliser les méthodes de cristallisation ;
4. Contrôler la quantité de tensioactif et de lipides associés à la protéine ; 5. Cristalliser le complexe RC-LH1-pufX.
Ainsi, nous souhaitions tirer profit au maximum de l’utilisation coordonnée de trois voies d’optimisation de la cristallisation in surfo (utilisation de nouveaux amphiphiles,
contrôle de l’excès de détergent et rationalisation de la cristallisation), pour, peut être, pouvoir améliorer dans un second temps la qualité des cristaux du complexe RC-LH1-pufX de Rhodobacter blasticus.
Dans le chapitre 1, nous expliquerons sur quels critères ont été développés, jusqu’à présent, les nouveaux amphiphiles conçus pour la manipulation des protéines membra- naires et pourquoi nous avons sélectionné 4 d’entre eux pour notre étude. Nous conclurons ce chapitre par la présentation des synthèses que nous avons réalisées. Le chapitre 2 sera consacré à la caractérisation physico-chimique en solution de ces 4 tensioactifs, que nous comparerons au DDM. Cette partie importante de la thèse nous permettra (i) d’éclairer la relation entre la structure de ces composés et leur comportement en solution, qui est déterminant pour la cristallisation, et (ii) de cibler les meilleurs candidats pour la cris- tallogénèse, que nous souhaitons ensuite tester sur le complexe protéique RC-LH1-pufX. Avant cela nous avons développé dans le chapitre 3 une méthode de dosage des tensioac- tifs par HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatographie afin de pouvoir mesurer la quantité de tensioactif lié à la protéine dans la bouée. Grâce à cette technique, nous avons pu caractériser le complexe protéine/détergent/lipide du RC-LH1-pufX après pu- rification, aussi bien en terme de tensioactif que de lipides (chapitre 4 ). Enfin le dernier chapitre sera dédié aux essais de cristallisation du complexe RC-LH1-pufX en liaison avec l’étude physico-chimique des tensioactifs. Pour finir, une conclusion générale présentera les perspectives qu’ouvre ce travail de thèse.
Les tensioactifs
Dans ce chapitre nous allons revenir sur les propriétés et caractéristiques générales des tensioactifs, avant de dresser une liste non exhaustive des molécules dont le design a été imaginé spécialement pour le maintien en solution et/ou la cristallisation des protéines membranaires. Nous présenterons les motivations qui ont guidé le choix des quatre familles de tensioactifs étudiées dans ce travail, et détaillerons les synthèses de ces composés qui ont été réalisés.
1 Généralités sur les tensioactifs
Les propriétés physico-chimiques des tensioactifs vont souvent dépendre de la nature de leurs têtes polaires (figure 1.1), c’est pourquoi ils sont souvent regroupés en quatre classes :
– Les tensioactifs anioniques dont la tête polaire porte une charge négative. Ce sont par exemple des carboxylates, des sulfates, des sulfonates ou des phosphates (ex : SDS).
– Les tensioactifs cationiques qui présentent une charge positive. Les plus courants ont une tête de type ammonium quaternaires, ou pyridinium.
Ces deux familles peuvent être regroupées sous l’étiquette des tensioactifs io-
niques.
– Les tensioactifs zwitterioniques ou amphotères dont la partie polaire comporte une charge négative et une charge positive qui s’annulent. Ces composés sont donc globalement neutres, comme les oxides d’amine.
– Les tensioactifs non ioniques qui ne possèdent aucune charge. Ce sont générale- ment des dérivés de glucoside, maltoside ou du polyéthylène glycol (PEG).
Figure 1.1 – Les différentes classes de tensioactifs : quelques exemples de structures de tensioactifs classées selon la nature de la tête polaire
D’autres classifications des tensioactifs existent toutefois, comme par exemple celles réalisées selon les propriétés de leur partie hydrophobe : leur nature (hydrocarbonée, fluorocarbonée ou silylée), leur caractère (saturé ou insaturé), leur structure (linéaire, cyclique ou ramifiée), leur nombre (mono-, bi- ou tri-catenaire). Enfin les tensioactifs peuvent aussi être regroupés en fonction des caractéristiques physico-chimiques de leur micelle, que nous allons à présent définir.