Il existe plusieurs techniques pour obtenir la structure des protéines : la cristallogra- phie aux rayons X, la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) et la microscopie électronique avec la microscopie à force atomique (AFM) ou la cryomicrosco- pie.
1.3.1 La cristallographie aux rayons X
La détermination de la première structure 3D de protéine membranaire par cristal- lographie date des années 80 [4]. Depuis, cette technique est de loin celle ayant permis d’obtenir le plus grand nombre de succès en biologie structurale. Sa principale limitation
réside dans la nécessité d’obtenir des cristaux de protéines de grande qualité, comme nous le verrons au paragraphe2.
Le cristal est un état solide ordonné : il est constitué d’un nombre très élevé de mo- lécules identiques (de l’ordre de 1012-1015) disposées de façon répétée et périodique dans
l’espace. L’interaction d’un faisceau de rayons X avec le cristal va produire un signal dif- fracté caractéristique de la géométrie du réseau cristallin. La position et l’intensité des rayons diffractés par le cristal est enregistrée par un détecteur sous forme de tâches de diffraction. La transformée de Fourier de l’intensité et des phases des ondes diffractées permet d’obtenir la densité électronique au sein du cristal et ainsi de construire le modèle protéique.
1.3.2 La RMN
L’étude structurale par RMN (résonance magnétique nucléaire) permet de convertir les propriétés magnétiques des noyaux des atomes en informations géométriques de la molécule et remonter ainsi par calcul à la structure 3D de la protéine. Il existe deux méthodologies qui se basent sur l’analyse des spins de l’hydrogène 1H, du carbone 13C et
de l’azote15N pour l’analyse des protéines : la RMN en phase liquide et la RMN en phase
solide. Le grand avantage de la RMN du liquide est qu’elle nécessite moins de préparation de l’échantillon que d’autres techniques de caractérisation structurale puisqu’elle utilise des protéines solubilisées et purifiées en micelles de détergent [5]. Les échantillons analysés doivent cependant être en concentration extrêmement élevée.
La première structure de protéine membranaire obtenue par RMN a été déposée dans la PDB en 1997 [6]. Depuis la technique s’est développée mais reste souvent limitée aux assemblages protéine/détergent/lipide de petites tailles (<30 kDa).
1.3.3 La microscopie électronique
La microscopie électronique a été utilisée pour la première fois par De Rosier et Klug en 1968 pour obtenir une structure 3D d’un échantillon biologique [7]. Elle requiert l’ob- tention d’un grand nombre de clichés 2D de l’objet étudié sous différentes orientations. En regroupant informatiquement les images d’une même orientation, le rapport signal sur bruit est augmenté et permet d’obtenir une image 2D précise de la particule. En procé- dant ainsi sur toutes les orientations, il est alors possible d’obtenir une structure 3D de la protéine.
La préparation des échantillons se fait généralement par congélation flash, on parle alors de cryomicroscopie. Les protéines en solution sont plongées dans l’azote liquide, l’eau du solvant est ainsi congelée sous forme de glace amorphe qui n’endommage pas la forme des protéines qu’elle contient. La structure de la bactériorhodopsine a pu être obtenue à haute résolution [8] par cette technique mais dans la plupart des cas la résolution reste moyenne (5 à 10 Å) comme par exemple pour le complexe Sec YEG [9].
1.3.4 La microscopie à force atomique (AFM)
La microscopie à force atomique permet de visualiser des images de membranes natives
ex cellula, conservées dans un tampon proche des conditions physiologiques [10]. Elle
repose sur l’analyse point par point de la surface de l’objet étudié par un balayage avec une pointe qui va suivre le relief de l’objet. Les récents progrès technologiques rendent cette technique capable d’observer des détails nanométriques et d’étudier la dynamique des protéines [11]. Cependant, les différents traitements utilisés pour observer les membranes par cette technique peuvent modifier "l’état natif" des membranes. [12,13].
1.3.5 La modélisation moléculaire
A la frontière entre la biologie structurale et la bio-informatique, la modélisation mo- léculaire se sert de calculs informatiques pour effectuer des prédictions de structures ter- tiaires. Elle repose souvent sur des homologies de séquences avec des protéines dont la structure est résolue ou sur la description des forces moléculaires subies par les atomes pour trouver des conformations d’énergie minimale.
Cet outil est aussi de plus en plus utilisé pour réaliser des simulations de dynamique moléculaire sur les structures connues pour étudier les mouvements des protéines au cours de leur activation physiologique. Il est ainsi possible d’obtenir, par modélisation, des infor- mations sur la fonction de la protéine en réalisant, par exemple, l’étude d’une protéine au cours d’un cycle catalytique. Les principales protéines étudiées de cette façon sont les ca- naux ioniques, les aquaporines, et les différents transporteurs. Ces simulations permettent notamment de tenir compte de l’environnement de la protéine membranaire (bicouche li- pidique, présence d’eau, et d’ions...) [14].
2 La cristallisation des protéines membranaires
La cristallographie des rayons X est, parmi toutes ces méthodes, celle qui est la plus utilisée en biologie structurale. Toutefois, la résolution de structures de protéines mem- branaires connait des succès beaucoup moins fréquents que pour les protéines solubles. Ce retard s’explique en grande partie par la difficulté à obtenir des cristaux de protéine mem- branaire. En nous appuyant sur les ouvrages de So Iawata [15] et de Ducruix et Giegé [16] ainsi que la revue de A. Seddon [17], nous allons dans ce paragraphe, présenter plus en détails l’étape, au combien délicate, de la cristallisation des protéines membranaires.