Après avoir accompli la synthèse de ces sondes, nous avons souhaité évaluer leurs capacités au cours d’expériences de target-fishing. La protéine utilisée est le même modèle que précédemment, c’est-à-dire une myoglobine portant des alcynes terminaux Myo-Alk.
Etude en milieu homogène du comportement des sondes
Des expériences de contrôle ont été réalisées en milieu homogène, c’est-à-dire sans réaliser de capture sur support solide, dans le but d’optimiser les différents paramètres réactionnels.
Nous avons tout d’abord souhaité contrôler la capacité des sondes Probe 1–4 à réagir avec la myoglobine Myo-Alk. Pour cela, nous avons réalisé la CuAAC, directement suivie de la réaction de click & release avec le DBCO, sans l’étape de capture sur le support (Figure 217).
Figure 217 : CuAAC suivie d'addition de DBCO monotope ; Gel d’électrophorèse, * Etape 1 uniquement ; MM = marqueurs moléculaires ; Partie inférieure : Révélation au bleu de Coomassie ; Partie supérieure : Signal de fluorescence ;
Rappel des structures des quatre sondes utilisées.
La réaction de CuAAC a été réalisée à plus basse concentration en protéines que précédemment afin de s’approcher des conditions physiologiques (14.8 µM plutôt que 84 µM). Après révélation au bleu de Coomassie, nous retrouvons de la myoglobine MYO-Alk n’ayant pas réagi quantitativement lors de la CuAAC pour les sondes ne portant pas un azoture chélatant Probe 1 et Probe 3. A l’inverse, les sondes Probe 2 et Probe 4 conduisent à la conversion totale de MYO-Alk en protéine marquée. Les concentrations en protéine que nous souhaitons pêcher étant inférieures à celle de cette réaction test, nous choisissons de ne pas poursuivre l’étude de la sonde Probe 3. Nous pouvons également observer
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l’allumage en fluorescence de la protéine marquée pour les sondes Probe 3 et Probe 4, confirmant la possibilité d’apporter un signal supplémentaire de façon intrinsèque à la sonde.
Nous avons ensuite souhaité déterminer la quantité minimale de sonde à utiliser pour réaliser la CuAAC de manière quantitative à la fois dans du tampon mais également en présence d’autres protéines. Cela a été fait avec la molécule Probe 4, dont le signal fluorescent post réaction avec le DBCO permet la visualisation par un imageur et l’évaluation de la conversion de la réaction, ce qui est particulièrement pratique lorsque la réaction est réalisée dans de l’extrait protéique (Figure 218).
Figure 218 : : CuAAC suivie d'addition de DBCO monotope dans le PBK ou en milieu complexe ;
MYO-Alk/autres protéines < 1/200 ;
Gel d’électrophorèse : Partie inférieure : Révélation au nitrate d’argent ; Partie supérieure : Signal de fluorescence. Cette étude a été réalisée sur une plus faible concentration de Myo-Alk (250 nM) en employant des concentrations de sonde allant de 1 à 20 µM. Dans le PBK, nous constatons qu’il faut au minimum 3 µM de sonde pour observer un marquage et que celui-ci est total à 5 µM. En milieu complexe, la CuAAC est moins efficace puisqu’il faut utiliser une concentration en sonde de 10 µM pour avoir un marquage quantitatif. Cela est probablement dû à une captation de la sonde par les autres protéines, réduisant sa disponibilité.
Concernant le système catalytique, des expériences ont montré qu’une incubation préalable à haute concentration de l’azoture chélatant avec le cuivre et le THPTA suivie de l’addition du réducteur étaient favorables à la CuAAC. Il a également été montré que le THPTA avait le rôle de piège pour les espèces radicalaires issues de la réduction du cuivre par l’ascorbate de sodium. En milieu complexe, la CuAAC fonctionne en l’absence de THPTA, validant l’effet chélatant du cuivre par le benzimidazole. Dans ce cas les radicaux sont piégés par les protéines du milieu.
Enfin, nous avons vérifié que la réaction de click & release se faisait de manière satisfaisante en utilisant différents cycloalcynes. Cela a été établi par des expériences de spectrométrie de masse MALDI (voir SI) avec les sondes Probe 2 et Probe 4 ainsi que par fluorescence pour la sonde Probe 4 portant un groupement pro-fluorescent (Figure 219).
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Figure 219 : Tests des différents cyclooctynes avec la sonde pro-fluorescente Probe 4 ;
Gel d’électrophorèse : Partie inférieure : Révélation au nitrate d’argent ; Partie supérieure : Signal de fluorescence Grâce à cette expérience en solution, nous confirmons la compatibilité de différents cycloalcynes, en l’occurrence de DBCO fonctionnalisé par un acide ou une amine, ainsi que du BCN. La cinétique de réaction des iminosydnones avec le BCN étant en moyenne 10 fois plus lente qu’avec le DBCO, nous avons utilisé une concentration en BCN de 10 mM (versus 1 mM pour les DBCO) afin d’avoir un avancement comparable à un temps donné. L’intensité de fluorescence ainsi que la bonne définition des bandes sur le gel d’électrophorèse nous indiquent que ces trois conditions sont équivalentes.
Expériences de target-fishing : CuAAC, Capture, Clivage
Après avoir étudié les deux réactions clés de l’expérience en solution, nous avons ajouté l’étape de capture et de lavage. La protéine pêchée sera ainsi séparée des autres espèces présentes dans le milieu initial. Nous avons pour cela utilisé la sonde Probe 2, que nous avons généralement clivée avec un DBCO fluorescent pour marquer la protéine, ainsi que la sonde pro-fluorescente Probe 4 que nous avons généralement clivée avec un DBCO non fonctionnalisé.
Le clivage du support solide apporte un défi supplémentaire par rapport à la réaction effectuée en solution. En effet des problématiques d’accès aux fonctions réactives deviennent essentielles à l’interface liquide/solide. De plus il est nécessaire d’envisager d’éventuelles interactions non- spécifiques entre les différentes espèces.
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Le protocole général de ces expériences de target-fishing est illustré dans la Figure 220.
1 6 9 5 1 .3 7 D a 1 7 2 3 8 .9 6 D a 1 7 5 2 6 .5 3 D a 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 7 x10 Intens. 15000 16000 17000 18000 19000 m/z 1 6 9 5 1 .3 9 D a 1 7 5 1 5 .8 3 D a 1 8 0 8 0 .8 4 D a 0 1 2 3 4 6 x10 Intens. 15000 16000 17000 18000 19000 m/z MYO-I MYO-Pyr2 a) b) 1 6 9 5 1 .3 7 D a 1 7 2 3 8 .9 6 D a 1 7 5 2 6 .5 3 D a 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 7 x10 Intens. 15000 16000 17000 18000 19000 m/z 1 6 9 5 1 .3 9 D a 1 7 5 1 5 .8 3 D a 1 8 0 8 0 .8 4 D a 0 1 2 3 4 6 x10 Intens. 15000 16000 17000 18000 19000 m/z MYO-I MYO-Pyr2 a) b) 1 6 9 5 1 .3 7 D a 1 7 2 3 8 .9 6 D a 1 7 5 2 6 .5 3 D a 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 7 x10 Intens. 15000 16000 17000 18000 19000 m/z 1 6 9 5 1 .3 9 D a 1 7 5 1 5 .8 3 D a 1 8 0 8 0 .8 4 D a 0 1 2 3 4 6 x10 Intens. 15000 16000 17000 18000 19000 m/z MYO-I MYO-Pyr2 a) b)
Figure 220 : Protocole général des expériences de target-fishing réalisées ; M = milieu (PBK ou extrait protéique). Pour toutes les expériences présentées par la suite, nous avons systématiquement analysé les surnageants, lavages et billes obtenus durant la procédure en plus des protéines décrochées par addition du cycloalcyne. Cela nous permet de vérifier :
si la CuAAC est totale (surnageant),
si l’intégralité des produits biotinylés sont captés par les billes (surnageant), s’il existe des interactions non spécifiques (lavages, billes, release),
si le clivage par les cycloalcynes est total (billes).
Encouragés par l’efficacité des réactions effectuées en solution, nous avons engagé la sonde Probe 4 dans la première expérience de target-fishing pour pécher MYO-alk à 1 µM en milieu simple ainsi qu’en milieu complexe (Figure 221).
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Figure 221 : Expérience de target-fishing de Myo-Alk avec Probe 4 en milieu simple (I, III, V, VII) et en milieu complexe (II, IV, VI, VIII); Gel d’électrophorèse capillaire : (I), (II) Expérience réalisée en solution (étapes 1 et 4) ;
(III), (IV) Surnageants obtenus après traitement des billes avec une solution de DBCO-CO2H dans le DMSO ; (V), (VI) Billes de Streptavidine post clivage ; (VII), (VIII) Surnageants obtenus après le lavage des billes (VII & VIII) ; MM = marqueurs moléculaires ; Partie inférieure : Révélation au nitrate d’argent ; Partie supérieure : Signal de fluorescence.
L’expérience a également été réalisée en solution (I et II), aux mêmes concentrations que pour les expériences de target-fishing complètes, afin d’avoir une référence en termes d’intensité de fluorescence et pour la révélation à l’argent. L’intensité de fluorescence obtenue pour ces puits est similaire, confirmant la bioorthogonalité des réactions.
Les résultats observés sur le gel d’électrophorèse (Figure 221) nous permettent de tirer plusieurs conclusions et points d’amélioration :
Pour les différentes étapes analysées, les puits correspondants au tampon PBK et ceux correspondants à l’extrait protéique montrent la même intensité de fluorescence. La CuAAC, ainsi que la réaction de click & release se font avec la même efficacité quel que soit le milieu.
La présence de myoglobine non capturée dans les surnageants démontre que le volume de billes utilisé doit être augmenté.
On retrouve de la myoglobine cible sur les billes de Streptavidine. Celle-ci peut s’y trouver soit parce que la réaction avec les cycloalcynes n’est pas totale, soit à cause d’interactions non spécifiques.
Pour le milieu complexe, on observe une proportion non négligeable de protéines du milieu dans ce qui a été clivé. Ceci peut être est dû à des interactions non spécifiques entre ces protéines et les différentes surfaces (billes, eppendorf). Les expériences suivantes nécessiteront des étapes de lavage supplémentaires, ainsi qu’un transfert du support solide dans un eppendorf propre au cours des lavages.
La capture est la première optimisation que nous avons faite. Nous avons réalisé cette expérience avec les deux sondes Probe 2 et Probe 4 sur la même échelle de myoglobine que la réaction précédente. Nous leur avons opposé différentes quantités de billes pour déterminer une quantité
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minimale de bille par nmole de sonde utilisée, représentant la quantité de biotine à capter. Ainsi nous avons déterminé qu’il fallait 25 µL de billes de Streptavidine pour capter 0.1 nmole de biotine à la fois pour Probe 2 et pour Probe 4 (250 µL/nmole).
Nous avons par la suite focalisé notre attention sur l’optimisation de la réaction de click & release avec les cycloalcynes. De nombreuses expériences ont été réalisées dans ce but en faisant varier un grand nombre de paramètres qui sont résumés dans le Tableau 12. Pour comparaison avec les résultats précédents, on quantifie le clivage obtenu précédemment (Figure 221) comme partiel (M).
Entrée Sonde
𝑽𝒃𝒊𝒍𝒍𝒆𝒔
𝒏𝒎𝒐𝒍𝒆𝑷𝒓𝒐𝒃𝒆 𝑿
(µL/nmole)
Equivalents de
sonde Probe X Autres paramètres Résultat
1 Probe
4 125 13 M
2 Probe
4 500 10
- DBCO 10 fois plus
concentré S 3 Probe 4 500 10 - Lavage Laemmli 1/20X S 4 Probe 4 500 10 - Lavage Brij - Clivage avec 3 cyclooctynes 0 5 Probe
4 110 6.6 - Lavage avec EDTA 1mM S
6 Probe
2 125 6.6
- Deuxième clivage DBCO- CO2H Clivage 1 : M Clivage 2 : 0 7 Probe 2 125 6.6 - Lavage Laemmli 1/20X post-clivage Clivage : M Lavage : M 8 Probe 2 300 3.3 - Lavage Laemmli 1/20X post-clivage Clivage : M Lavage : M Tableau 12 : Variation de paramètres pour optimiser le clivage des iminosydnones sur le support solide ;
Entrée 1 : rappel de l’expérience décrite en Figure 221 ; S = traces de clivage ; M = Clivage partiel. La sonde Probe 4 est clivée avec DBCO-CO2H tandis que Probe 2 est clivée avec DBCO-TAMRA.
Afin d’intervenir sur la réactivité entre l’iminosydnone et le cycloalcyne en tant que telle, nous avons fait varier la nature du partenaire alcyne ainsi que sa concentration (Entrées 2, 4). Ces facteurs sont restés sans impact sur la quantité de myoglobine récupérée. L’ajout de DBCO sur le support ayant subi un premier clivage ne relargue pas de protéine supplémentaire (Entrée 5).
Nous avons imaginé que l’éventuelle présence de cuivre resté chélaté ainsi que des autres composants du système catalytique pourrait perturber la réaction de click & release. Nous avons ainsi procédé à des lavages supplémentaires du support avant l’ajout du cyclooctyne (Entrées 3, 4, 5). Ces différents lavages n’ont pas permis d’améliorer le clivage.
En revanche, il apparaît qu’une quantité non négligeable de protéine relarguée est retenue sur le support par des interactions intolérantes au lavage par du Laemmli dilué puisque celui-ci permet de décrocher plus de protéines (Entrées 7 et 8).
Enfin, nous observons une amélioration nette du clivage lorsque le nombre moyen de biotine par myoglobine diminue (Entrées 6, 7, 8). Nous avions en effet observé que les protéines restant sur les billes étaient fluorescentes, impliquant que la réaction avec le cycloalcyne se faisait. Notre hypothèse
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est que les iminosydnones les plus accessibles réagissaient en premier lieu, créant le signal fluorescent par accroche du TAMRA / formation du pyrazole. L’unité générée pouvait alors créer une gêne stérique pour l’accès à l’iminosydnone la plus enfouie, retenant la protéine sur le support.
Nous avons alors réalisé l’expérience de target-fishing en utilisant uniquement un équivalent de sonde afin d’avoir une seule iminosydnone par protéine. Cette expérience a été réalisée à la fois avec la sonde Probe 2 ainsi que la sonde Probe 4 (Figure 222).
Figure 222 : Expérience de target-fishing de Myo-Alk avec un équivalent de Probe 2 (I–VI) et Probe 4 (VII–XII) dans PBK ; Gel d’électrophorèse capillaire : (I), (VII) Référence CuAAC, étape 1 ;
(II), (VIII) Référence CuAAC + Click & Release, étapes1 + 4 ; (III), (IX) Surnageants post capture ; (IV),(X) Surnageants obtenus après traitement des billes avec une solution de DBCO-CO2H ou DBCO-TAMRA ;
(V),(XI) Lavage des billes avec du Laemmli 1/20X ; (VI), (XII) Billes de Streptavidine post clivage; Partie inférieure : Révélation au nitrate d’argent ; Partie supérieure : Signal de fluorescence.
La réaction de CuAAC n’est pas totale, la protéine n’ayant pas réagi est retrouvée ainsi dans le surnageant (III, IX). En revanche, notre hypothèse concernant le bénéfice d’une fonctionnalisation moindre sur le clivage de l’iminosydnone se révèle exacte puisque l’intégralité de la protéine est décrochée du support pour la sonde Probe 2. En revanche, la sonde Probe 4 montre toujours un clivage incomplet.
Conclusions et perspectives des sondes de target-fishing
Nous avons synthétisé 4 sondes de target-fishing et éprouvé leurs capacités dans diverses expériences sur des protéines modèles. Deux d’entre elles possèdent un azoture portant un groupement benzimidazole chélatant et permettent d’abaisser les concentrations d’alcynes pouvant réagir dans la CuAAC. En revanche, le clivage quantitatif des sondes a été observé lorsque nous n’avons utilisé qu’un très léger excès de sonde Probe 2, favorisant la formation d’espèces mono-biotinylées. Ce cas se rapproche plus d’une application à une problématique concrète de target-fishing pour des protéines ne possédant qu’un seul alcyne. La généralisation de cette preuve de concept est actuellement en cours au laboratoire.
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Nous avons ainsi démontré l’efficacité des iminosydnones en tant qu’espaceurs clivables. L’étape de ‘’click’’ de la réaction de click & release a également été valorisée puisqu’elle permet d’apposer un marquage à la protéine pêchée.
Nous souhaitons également montrer la généralité de la méthode pour du trans-tagging avec d’autres types de marquages. La synthèse d’un cycloalcyne portant un marqueur pour l’analyse de masse est en cours de préparation.