La limitation de cet outil provient de la réaction de CuAAC. Dans cet exemple la ligation a été effectuée dans le PBK à ‘’haute’’ concentration (84 µM) avant de créer le mélange artificiel de myoglobine dans l’extrait protéique. A faible concentration et en milieu complexe, cette réaction s’est montrée inefficace. Notre premier objectif concernant ces sondes de target-fishing est d’être aptes à effectuer l’étape de bioconjugaison en milieu complexe et à faible concentration. Ainsi, nous imaginons que l’utilisation d’azotures chélatants permettrait d’obtenir une réaction de CuAAC répondant à ces critères.45
Par ailleurs, nous utilisons la réaction de click & release pour apporter un marquage fluorescent. Dans les outils communs de target fishing, ce marquage est inhérent à la sonde. Nous imaginons ajouter l’information fluorescente à la sonde iminosydnone et utiliser le cycloalcyne pour apporter une seconde information, tel qu’une étiquette pour la spectrométrie de masse.268 Pour cela, nous souhaitons utiliser une iminosydnone pro-fluorescentes s’inspirant de celles développées précédemment (cf. Chapitre 2).
Notre objectif est donc de concevoir de nouvelles générations de sondes répondant à ces deux problématiques (Figure 210).
Figure 210 : Nouvelles générations d’iminosydnones envisagées
268 O. Koniev, G. Leriche, M. Nothisen, J.-S. Remy, J.-M. Strub, C. Schaeffer-Reiss, A. Van Dorsselaer, R. Baati, A.
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Synthèse
Synthèse d’une sonde iminosydnone-chelazide pour le target- fishing
L’azoture chélatant que nous avons sélectionné pour fonctionnaliser l’iminosydnone possède un groupement benzimidazole. Il a été décrit par notre groupe pour accélérer la CuAAC d’un facteur de l’ordre de 2000.45,269 Afin de greffer cet azoture à l’iminosydnone, nous avons synthétisé le composé 78 portant une amine en suivant une voie de synthèse décrite au laboratoire (Figure 211).269
Figure 211 : Accès synthétique à l’azoture chélatant 78.
Le (1H-benzoimidazol-2-yl)methanol est tout d’abord alkylé par un bromo-ester dans l’éthanol au reflux pour obtenir le produit 74 avec un rendement de 42%. L’alcool primaire est mésylé puis substitué par un azoture pour donner le synthon 75 avec un rendement de 85%. L’ester est alors clivé et l’acide résultant 64 est couplé avec une diamine monoprotégée par un groupement Boc avec un rendement de 52% sur deux étapes. Le produit 78 est enfin obtenu de manière quantitative par déprotection du groupement Boc avec l’acide trifluoroacétique.
Le synthon 78 peut ensuite être couplé avec l’iminosydnone acide 26k décrite précédemment en utilisant HATU comme agent de couplage. On obtient ainsi l’iminosydnone 79 avec un rendement de 54%. Celle-ci subit alors une déprotection au TFA pour être couplée avec le même bras PEG-biotine portant un ester activé que pour le produit Probe 1. La sonde Probe 2 est ainsi obtenue avec un rendement de 42% après purification par HPLC préparative (Figure 212).
269 V. Bevilacqua, Développement de nouveaux ligands et azotures chélatants pour la cycloaddition alcyne-
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Figure 212 : Synthèse de la sonde Probe 2 à partir de l’iminosydnone 26k.
Synthèse d’une sonde de target-fishing pro-fluorescente
Parmi les sondes pro-fluorescentes synthétisées précédemment, seules celles possédant le groupement pro-fluorescent sur l’azote N3 de l’iminosydnone sont intéressantes pour notre concept de sondes. Il s’agit en effet de cette partie de la sonde qui restera liée à la protéine après la réaction de click & release.
Malgré les facilités synthétiques évidentes que représentent les sondes substituées par les styryls, nous avons sélectionné le motif styryl-pyridinium pour ses propriétés optiques plus intéressantes.
La synthèse d’une telle sonde nécessite la condensation d’un aldéhyde avec le picolinium 81 portant un azoture. Celui-ci a été obtenu selon une procédure de la littérature (Figure 213).270
Figure 213 : Synthèse de la sonde Probe 3.
Pour obtenir la sonde de target-fishing correspondante, nous avons généré l’aldéhyde 82 à partir de l’iminosydnone 8k déjà fonctionnalisée en position N6. Nous avons utilisé le couplage de Suzuki avec
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le boronate portant un acétal comme précédemment (cf. Chapitre I). La condensation avec le picolinium 81 est ensuite réalisée dans le méthanol à 60 °C pour obtenir le produit 83, isolé par précipitation dans l’éther diéthylique avec un rendement de 48%. Ce dernier subit alors les étapes de déprotection et couplage déjà employée pour la synthèse de Probe 1 et Probe 2 pour obtenir la sonde profluorescente Probe 3, purifiée par HPLC préparative, avec un rendement de 41%.
Synthèse d’une sonde de target-fishing profluorescente portant un azoture chélatant
La préparation de cette nouvelle sonde portant à la fois un pyridinium et un azoture chélatant de type benzimidazole s’est révélée délicate et a nécessité de nombreuses approches.
Notre première stratégie a été la formation d’un picolinium portant un azoture chélatant en suivant la même stratégie que précédemment, soit via l’alkylation de la 4-methyl picoline par le 1,3-diiodopropane suivie d’une seconde alkylation (Figure 214).
Figure 214 : Essais de formation d’azoture chélatant benzimidazole portant un picolinium en utilisant 80. La formation de 80 se fait avec un excellent rendement et aucun produit portant deux picolines n’est observé. Les conditions optimisées d’alkylation de 80 avec le (1H-benzoimidazol-2-yl)methanol donnent le produit 84 avec un rendement de 14%. D’autres stœchiométries et d’autres solvants ont été évalués pour cette réaction, ils mènent soit à la formation exclusive du produit vinylique issu de l’élimination de l’iode, soit à un mélange inséparable dans nos mains du fait de la polarité des produits. La problématique de purification a été le frein majeur pour toutes les réactions employant des benzimidazoles portant un picolinium. Ainsi, toute réaction incomplète ou générant de multiples sous- produits n’est pas utilisable pour cette synthèse. Le produit 85, issu de la mésylation de 84 puis substitution par un azoture peut ainsi être observé, mais la réaction n’atteignant pas complétion, il nous a été impossible d’obtenir le produit propre.
En utilisant l’azoture de diphényl-phosphoryle, nous avons pu générer le produit 86 avec un rendement de 62%.271 Malheureusement, la réaction suivante qui est l’alkylation avec le produit 80 donne à nouveau un mélange de produits inséparables.
271 S. Tommasi, C. Zanato, B. C. Lewis, P. C. Nair, S. Dall’Angelo, M. Zanda, A. A. Mangoni, Org. Biomol. Chem.
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Notre seconde approche (Figure 215) a été d’alkyler la picoline avec un bromo-ammonium. La réaction se fait en l’absence de base pour obtenir le double sel désiré 88 avec un rendement de 90%.272 Ce produit peut ensuite être couplé avec 76 pour donner le synthon 89 avec un rendement de 50%. Malgré sa grande polarité, il a été possible de purifier ce produit par chromatographie sur colonne en phase normale.
Figure 215 : Synthèse de l’azoture chélatant 89 portant un picolinium.
Nous avons ensuite réalisé la condensation entre 89 et 82. Le produit est obtenu en mélange avec le produit de départ. Ce mélange est engagé dans les deux étapes suivantes permettant d’obtenir la sonde Probe 4 après purification par HPLC préparative avec un rendement de 13% sur trois étapes (Figure 216).
Figure 216 : Synthèse de la sonde de target-fishing pro-fluorescente portant un azote chélatant Probe 4.
272 S. P. Gromov, A. I. Vedernikov, N. A. Lobova, L. G. Kuz’mina, S. N. Dmitrieva, Y. A. Strelenko, J. A. K. Howard, J.
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