Le transfert d’énergie par résonnance en fluorescence, parfois appelée transfert d’énergie par résonnance de type Förster (FRET), du nom de son découvreur, est un phénomène qui se produit entre un fluorophore donneur (D) et une entité acceptrice (A) fluorescente ou non.191,192 Lorsque la paire donneur/accepteur est optimale, l’excitation du donneur provoque un transfert d’énergie non radiative vers l’accepteur. Si l’accepteur est un fluorophore, il émet alors un rayonnement à sa longueur d’onde d’émission (Figure 128). L’entité acceptrice peut également être un chromophore non fluorescent. Dans ce cas, l’énergie transmise sera dissipée par des processus non radiatifs ; on observera uniquement l’extinction de fluorescence du fluorophore donneur.
L’efficacité de ce phénomène dépend de plusieurs paramètres qui sont : l’intégrale de recouvrement spectral entre l’émission du donneur et l’absorbance de l’accepteur, la distance spatiale entre les deux partenaires ainsi que leur orientation.
189 Y. Chen, C. M. Clouthier, K. Tsao, M. Strmiskova, H. Lachance, J. W. Keillor, Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53,
13785–13788.
190 J.-J. Shie, Y.-C. Liu, Y.-M. Lee, C. Lim, J.-M. Fang, C.-H. Wong, J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 9953–9961. 191 M.-C. Chirio-Lebrun, M. Prats, Bioch. Educ. 1998, 26, 320–323.
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Figure 128 : Principe de l’effet FRET illustré lorsque l’accepteur est un fluorophore.
Le phénomène de FRET a été largement utilisé dans différents domaines dans le but d’obtenir des informations structurales des systèmes étudiés. Cela est particulièrement vrai en biologie où le FRET est un outil employé pour étudier les interactions entre différentes biomolécules ainsi que les changements conformationnels des protéines.192
En ce qui concerne l’utilisation du FRET pour la conception de sondes activables pro-fluorescentes, les exemples de sondes utilisant ce phénomène ne sont pas très nombreux.
Le groupe de Bertozzi a développé une autre sonde pro-fluorescente activée par la ligation de Staudinger avec un azoture.193 Le fluorophore donneur est une fluorescéine, introduite sur le même noyau aromatique que la phosphine. L’accepteur du système FRET ici est un inhibiteur de fluorescence. Au cours de la ligation de Staudinger avec l’azoture, l’inhibiteur est clivé et ne peut plus jouer le rôle d’accepteur pour la fluorescéine dont la fluorescence est restituée avec un effet turn-on de 160 (Figure 129).
Figure 129 : Sonde activée par l'oxydation de la phosphine au cours de la ligation de Staudinger.
Cette sonde a également été utilisée comme marqueur de glycoprotéines fonctionnalisées par des azotures à la surface des cellules. En comparaison de la sonde activable par ligation de Staudinger précédemment développée par Bertozzi (cf Partie II–I–B–1-Le transfert de charge intramoléculaire (ICT)Autres sondes pro-fluorescentes), cette sonde possède l’avantage d’être toujours inhibée lorsque
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la phosphine s’oxyde spontanément, lui donnant de meilleures facultés pour des applications de marquage.
Au sein de la palette de réactions de la chimie click, la réaction de Diels Alder à demande électronique inverse entre les tétrazines et les alcènes nous offre un partenaire chromophore aux propriétés spectrales intéressantes pour des sondes FRET. En effet, les tétrazines sont des composés dont le maximum d’absorption est aux alentours de 500–525 nm. En 2010, le groupe de Weissleder synthétise des sondes tétrazines liées à différents fluorophores. Comme attendu, les fluorophores possédant une émission entre 400 et 600 nm ont pu être inhibés efficacement, mais pas ceux dont l’émission est hors de cette zone.194
Figure 130 : Sonde FRET BODIPY-tétrazine.
La sonde possédant un BODIPY comme donneur (Figure 130) a pu être utilisée in cellulo avec comme partenaire un trans-cyclooctène fonctionnalisé avec le taxol. L’excellente cinétique de réaction, conjuguée au bon effet turn-on de la sonde ont ainsi permis de visualiser le réseau microtubulaire, cible du taxol, avec des images de haute qualité.194
Le FRET entre la tétrazine et des fluorophores s’est montré efficace, mais ne concerne qu’une partie restreinte du spectre atteignable en fluorescence. En utilisant un lien plus court et moins flexible entre le fluorophore donneur et la tétrazine, il est possible d’obtenir des extinctions de fluorescence plus efficaces, mais également d’atteindre les zones spectrales hors du domaine d’absorbance de la tétrazine. Cela est dû à un autre effet d’extinction qui s’ajoute au FRET appelé TBET (Through Bond Energy Transfer), ce phénomène ne nécessite pas de recouvrement spectral entre les deux partenaires et a notamment été utilisé pour concevoir des fluorophores présentant de larges pseudo-déplacements de Stokes.195,196
Les efficacités d’extinction se sont révélées bien meilleures qu’avec l’utilisation seule du FRET. Effectivement, Weissleder et ses collaborateurs montrent qu’avec un espaceur rigide conjugué au BODIPY, il est possible d’avoir des sondes pro-fluorescentes BODIPY-tétrazines avec une exaltation de fluorescence allant jusqu’à 1600.197 Cette stratégie a également permis aux groupes de Weissleder et
194 N. K. Devaraj, S. Hilderbrand, R. Upadhyay, R. Mazitschek, R. Weissleder, Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49,
2869–2872.
195 G.-S. Jiao, L. H. Thoresen, K. Burgess, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 14668–14669. 196 W. Lin, L. Yuan, Z. Cao, Y. Feng, J. Song, Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 375–379.
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Devaraj d’obtenir d’excellentes sondes turn-on avec différents fluorophores comme des coumarines,198 des fluorescéines et rhodamines.199
Bien plus récemment, l’équipe de Wombacher a synthétisé une série de tétrazines turn-on couvrant une plus grande partie du spectre visible (Figure 131).200
Figure 131 : Gamme de tétrazines pro-fluorescentes mise au point par Wombacher.200
L’efficacité d’extinction de fluorescence diminue en allant vers les plus grandes longueurs d’onde. Malgré des valeurs de turn-on modestes pour les Si-rhodamines, ces composés ont pu être utilisés pour du marquage cellulaire tout en s’affranchissant de lavage. A nouveau l’excellente réactivité de la réaction de click IEDDA permet également une bonne efficacité du marquage en seulement 30 minutes.