Pour chacune des sondes étudiées, nous avons mesuré les spectres d’absorbance et de fluorescence des iminosydnones, des pyrazoles et/ou produits relargués. Les valeurs de turn-on ont été déterminées en excitant les produits à la longueur d’onde d’absorption maximale de l’état ‘’on’’.
Nous avons obtenu les produits issus de la réaction de click avec les cycloalcynes de différentes manières. Les pyrazoles proviennent de la réaction avec les sydnones correspondantes pour s’affranchir de la séparation du produit relargué par l’iminosydnone. Les coumarines et naphthalimides susceptibles d’être relargués ont été isolés suite à la réaction entre les sondes 53 et 54 avec le BCN. Les spectres de la fluorescéine et de la rhodamine B ont été pris sur les bruts réactionnels. Quant au dansyl sulfonamide libérée par les sondes 6b et 70, il est disponible commercialement.
La valeur du coefficient d’extinction molaire a été déterminée par régression linéaire au maximum d’absorption de trois solutions de concentrations différentes du même composé. Le rendement quantique a été déterminé de manière relative grâce à l’Équation 4 en utilisant une référence adaptée au rendement quantique connu, qui absorbe à la valeur d’excitation de notre produit et qui possède une émission dans la même zone.
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Les iminosydnones substituées en position N
3Le Tableau 9 récapitule les propriétés optiques obtenues pour les iminosydnones substituées sur l’aryl en position N3 ainsi que celles des pyrazoles correspondants après réaction avec le BCN.
Iminosydnone Pyrazole Entrée F S Sonde ex (nm) em (nm) f M-1.cm-1) ex (nm) em (nm) f M-1.cm-1) Brill. Turn- on 1 F1 S1 31a 344 446 0.017 25 575 339 374 0.196 33 192 6 505 33 2 F1 S2 33 355 508 0.049 22 306 26 3 F1 S3 32a 340 412 0.020 26 781 23 4 F1 S4 34 342 529 0.255 12 243 19 5 F2 S1 31b 361 591 0.327 24 806 342 370 0.099 27 313 2 703 21 6 F3 S1 31c 346 419 0.019 22 170 354 455 0.232 28 227 6 548 27 7 F3 S3 32b 344 392 0.008 26 259 47 8* F4 S1 39 378 493 0.019 28 128 403 582 0.105 33 948 3 564 19 Tableau 9 : Propriétés optiques des iminosydnones substituées sur l’aryl de la position N3 ainsi que des pyrazoles
correspondants ; Solvant : DMSO. * eau/DMSO, 80/20.
Nous constatons que les propriétés électroniques du substituant jouent un rôle important dans les propriétés optiques (Entrées 1, 5, 6, 8). On note un déplacement bathochrome de l’absorption et de l’émission des pyrazoles avec l’électroattractivité du substituant situé en para de l’aromatique branché en position N3. La gamme d’émission des pyrazoles est comprise entre 370 nm pour le substituant méthoxy-styryl, et 582 nm pour le pyridinium, permettant d’atteindre une large zone du spectre du bleu au jaune. Pour des applications d’imagerie, le motif pyridinium est particulièrement intéressant puisqu’il se rapproche du rouge, région dans laquelle l’auto-fluorescence des cellules est plus faible.
Les iminosydnones possèdent également une fluorescence résiduelle variable en fonction des substituants. L’effet observé est inversé au regard de celui obtenu avec les pyrazoles, c’est-à-dire que les groupements électroattracteurs sur la position N3 induisent un déplacement hypsochrome de l’émission. De la sorte, l’iminosydnone 31b portant un groupement donneur a une émission de fluorescence étonnamment élevée à 591 nm ainsi qu’un rendement quantique de l’ordre de 30% ce qui est assez significatif pour une émission si décalée vers le rouge. Cela en fait un piètre candidat en tant que sonde turn-on activée par réaction avec les alcynes puisque le pyrazole associé fluoresce bien trop bas.
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Les effets observés sont facilement rationnalisés puisque le noyau iminosydnone possède des qualités électroattractrices tandis que le pyrazole est donneur. Ainsi l’effet bathochrome, observé lorsque le moment dipolaire de la molécule est grand, est remarqué pour des couples iminosydnone/donneur et pyrazole/accepteur. C’est cette seconde possibilité qui est à sélectionner pour obtenir des sondes pro-fluorescentes efficaces pour le marquage.
L’influence des groupements situés sur l’azote exocyclique est moins évidente à rationnaliser. Nous avons étudié l’impact de différents substituants en N6 pour la même substitution en N3 (Entrées 1–4). Les substituants les plus attracteurs, amides et sulfonamides (Entrées 2, 4), induisent un accroissement du moment dipolaire et donc une émission de fluorescence décalée vers le rouge pour l’iminosydnone. Pour le carbamate et l’urée (Entrées 1, 3), la fluorescence résiduelle observée pour l’iminosydnone est plus faible.
L’ensemble des valeurs de turn-on est du même ordre de grandeur, avec comme meilleure sonde l’iminosydnone 32b qui a un turn-on de 47. Il s’agit également de l’iminosydnone possédant le rendement quantique le plus bas, c’est-à-dire la plus grande extinction ici.
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Les iminosydnones substituées en position N
6Le Tableau 10 récapitule les propriétés optiques obtenues pour les iminosydnones substituées en position N6 ainsi que celles des fluorophores relargués après réaction avec le BCN. Concernant la fluorescéine et la rhodamine B (Entrées 6–10), les turn-ons ont été déterminés sur les bruts réactionnels de réaction avec le BCN. Le signal fluorescent apporté par le pyrazole ainsi que le léger excès d’alcyne utilisé sont négligeables aux longueurs d’ondes utilisées pour ces fluorophores. Face à l’absence d’exaltation de fluorescence pour ces composés et aux faibles quantités d’iminosydnone en main, nous n’avons pas isolé les fluorophores relargués et n’avons pas déterminé les propriétés du fluorophore relargué (coefficient d’extinction molaire, rendement quantique et brillance).
Iminosydnone Fluorophore relargué
Entrée P X Sonde ex (nm) em (nm) f M-1.cm-1) ex (nm) em (nm) f M-1.cm-1) Brill. Turn-on 1 P1 H 53 411 466 0.006 10 294 387 465 0.510 10 516 5 363 86 2 P1 Br 59 407 469 0.041 28 438 6 3 P2 H 6b 341 405 0.004 10 294 338 510 0.439 4 884 2 144 283 4 P4 H 54 411 516 0.033 27 929 392 483 0.503 13 001 6 539 38 5 P4 Br 60 406 522 0.097 24 572 22 6* P5 H 55 495 515 n.d. 35 199 n.d. 515 n.d. n.d. n.d. 1,3 7* P5 Br 61 495 515 n.d. 65 356 1,3 8 P7 H 56 566 585 n.d. 92 177 n.d. 585 n.d. n.d. n.d. 1 9 P7 Br 62 566 585 n.d. 84 827 1,4 10 P7 I 63 566 585 n.d. 82 075 1
Tableau 10 : Propriétés optiques des iminosydnones substituées en position N6 ainsi que des fluorophores relargués
correspondants ; Solvant : DMSO –* PBS/DMSO, 80/20 – n.d. = non déterminé.
Nous constatons que le noyau iminosydnone éteint les fluorophores avec une efficacité variable (Entrées 1, 3, 4, 6, 8). La coumarine, le dansyl ainsi que le naphthalimide sont éteints de manière efficace (Entrées 1, 3, 4) avec des valeurs de turn-on comprises entre 38 et 283. Ces fluorophores peuvent ainsi être envisagés pour la conception de double sondes. En revanche, contrairement à nos attentes, la présence du brome en position C4 accroît l’émission de fluorescence de l’iminosydnone et
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fait chuter la valeur du turn-on en comparaison des dérivés hydrogénés (comparer les Entrées 1, 4 avec les Entrées 2, 5).
Le naphthalimide-urée libéré n’avait jamais été décrit auparavant, ses propriétés optiques nous étaient donc inconnues. L’émission de fluorescence de ce produit présente un décalage vers le bleu par rapport à son analogue aminé.221 Malgré une longueur d’onde d’émission plus basse que celle attendue, ce fluorophore reste intéressant dans le cadre de notre étude.
L’extinction de fluorescence de la fluorescéine et de la rhodamine B est négligeable voire inexistante (Entrées 6 et 8). Ces fluorophores ne sont pas exploitables pour l’élaboration de sondes turn-on à partir d’iminosydnones ; d’autant plus que l’on n’observe pas d’amélioration significative de l’exaltation de fluorescence avec l’introduction des halogènes en position C4 (Entrées 7, 9, 10).
Les iminosydnones substituées en position N
3et N
6Dans le Tableau 11 nous avons résumé les propriétés optiques obtenues pour les iminosydnones à double exaltation de fluorescence. En ce qui concerne les deux produits générés après la réaction de click avec le BCN, nous rappelons ici leurs longueurs d’onde d’excitation et d’émission. Les propriétés optiques détaillées de ces molécules issues de la réaction de click & release sont récapitulées dans le Tableau 9 pour les pyrazoles et dans le Tableau 10 pour les fluorophores relargués.
Iminosydnone Pyrazole Fluorophore relargué
Entrée F P Sonde ex (nm) em (nm) f M-1.cm-1) ex (nm) em (nm) Turn-on ex (nm) em (nm) Turn-on 1 F1 P2 70 345 377 0.003 18 654 339 374 29 338 510 97 2 F1 P4 66 415 473 0.012 32 349 26 392 483 31 3* F4 P4 69 396 482 0.015 35 561 403 582 18 22 4 F3 P1 65 349 467 0.007 29 441 354 455 33 387 465 22 Tableau 11 : Propriétés optiques des iminosydnones à double exaltation de fluorescence et des produits formés suite à
la réaction avec le BCN; Solvant : DMSO. * eau/DMSO, 80/20.
Les valeurs de turn-on pour la partie pyrazole de ces sondes sont complètement cohérentes avec celles déterminées pour les iminosydnones ne portant pas de second groupe pro-fluorescent. En revanche, le turn-on relatif au fluorophore lié à l’azote N6 est bien moindre que pour les iminosydnones analogues portant un phényl en position N3. On observe que le dansyl est le groupement délivrant le meilleur turn-on puisqu’il est 97 fois plus fluorescent que la sonde 70 (Entrée 1). La coumarine et le
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naphthalimide (Entrées 2–4), bien que moins efficaces que le dansyl, donnent des turn-on supérieurs à 20, suffisamment élevés pour obtenir de bons rapports signal sur bruit pour ces sondes.
Pour toutes les sondes, on obtient des rendements quantiques inférieurs aux iminosydnones à simple exaltation de fluorescence correspondantes. En effet, ces composés sont de meilleurs chromophores mais n’émettent pas de signal fluorescent plus élevé.
La sonde 65 (Entrée 4) donne après la réaction avec le BCN deux produits dont l’émission de fluorescence est trop proche pour être distinguée efficacement. Elle ne sera pas choisie pour réaliser les études suivantes. L’iminosydnone 69 (Entrée 3) est idéale pour l’imagerie in cellulo puisque les deux fluorophores générés possèdent des émissions distinctes et une longueur d’onde d’excitation suffisamment élevée, donc impliquant une irradiation pas trop énergétique pour imager les cellules. Par contre, l’intensité de fluorescence du naphthalimide relargué est largement supérieure à celle du pyrazole-pyridinium. Ainsi, la fluorescence observée à 582 nm provenant du pyridinium est équivalente en intensité à celle provenant du naphthalimide dont l’émission est large et intense. Cela nous empêche d’observer distinctement les deux signaux ‘’in vitro’’, mais cela est possible en microscopie comme nous le verrons par la suite (cf. Partie II-IV-B).