50 a été obtenue avec un rendement global de 34% selon une voie de synthèse décrite auparavant par alkylation de la morpholine par la 2-bromoethan-1-amine protégée

par un phtalimide puis déprotection du phtalimide.227 _{Cette amine obtenue peut être additionnée sur} 43 pour donner le produit 51, suivi par la réduction du nitro aboutissant au 52 avec un rendement de 36% sur deux étapes.

Synthèse de sondes iminosydnones pro-fluorescentes substituées sur l’aryle en position N6

La première sonde a été synthétisée dans le cadre de l’étude de la fonctionnalisation des iminosydnones. Il s’agit de l’iminosydnone-sulfonamide 6b portant un groupement dansyl (Figure 156).

Figure 156 : Rappel de la synthèse de l’iminosydnone 6b.

Nous avons pu observer de manière qualitative l’absence de fluorescence du produit 6b, particulièrement par chromatographie sur couche mince. Intrigués, nous avons poussé l’expérimentation à d’autres fluorophores comme les coumarines qui ont montré leur capacité à être éteintes par d’autres mésoioniques (i.e. les sydnones).

Nous avons donc mis en réaction le sel d’iminosydnone 4a et deux coumarines (Figure 157). La réaction avec la coumarine isocyanate (obtenue dans ce cas via un réarrangement de Curtius -Figure 150) permet d’obtenir la sonde 53 avec un rendement de 68%. En revanche le couplage avec la

225 _{H. Yu, Y. Xiao, L. Jin, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 17486–17489.} 226 _{T. Liu, Z. Xu, D. R. Spring, J. Cui, Org. Lett. 2013, 15, 2310–2313.}

227 _{X.-M. Yu, F. Ramiandrasoa, L. Guetzoyan, B. Pradines, E. Quintino, D. Gadelle, P. Forterre, T. Cresteil, J.-P.}

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coumarine-julolidine fonctionnalisée en position 3 par un acide ne permet pas d’obtenir l’iminosydnone-amide désirée mais la nitrosamine résultant de l’ouverture de l’iminosydnone.

Figure 157 : Réactions entre le sel d’iminosydnone 4a et différentes coumarines.

En ce qui concerne les naphthalimides, la génération de l’isocyanate avec le triphosgène dans le toluène avec la DIPEA précédemment décrite dans la littérature221 _{n’a pas permis d’obtenir} l’iminosydnone désirée probablement à cause de l’excès de DIPEA restant dans le milieu qui conduit à l’ouverture du squelette iminosydnone. Nous avons alors utilisé le protocole de génération des isocyanates avec le triphosgène en milieu biphasique. L’ajout du sel d’iminosydnone 4a a mené à la formation de la sonde désirée 53 avec un rendement de 45% (Figure 158).

Figure 158 : Synthèse de la sonde 53.

Pour la suite de nos travaux, nous nous sommes tournés vers des fluorophores ayant une émission à des longueurs d’onde plus élevées. Nous avons sélectionné les sondes xanthéniques fluorescéines et rhodamines.

La forme électrophile de la fluorescéine la plus utilisée est la fluorescéine-isothiocyanate (FITC). Malheureusement, cet isocyanate ne réagit pas avec l’iminosydnone 4a. Nous avons alors utilisé une amino-fluorescéine pour générer l’isocyanate et le faire réagir avec 4a. Les conditions habituelles en milieu biphasique ne permettent pas d’obtenir l’isocyanate. La formation de cet isocyanate est décrite de manière anecdotique dans un rapport datant de 1950.228 _{En nous inspirant de cet article dans lequel} les auteurs utilisent une solution d’acétone saturée de phosgène, nous avons changé le solvant réactionnel pour l’acétone. Après 30 minutes d’agitation à température ambiante, nous pouvons observer un changement de couleur du milieu réactionnel (du vert à l’orange), cohérent avec les

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observations décrite dans l’article précédent. L’urée désirée se forme après ajout du sel d’iminosydnone et nous avons pu isoler le produit 55 avec un rendement de 13% après purification (Figure 159).

Figure 159 : Réactions entre le sel d’iminosydnone 4a et différentes fluorescéines.

Les rhodamines sont des fluorophores largement utilisés pour l’imagerie in vivo. Plus particulièrement, le TAMRA, dont les azotes sont chacun substitués par deux méthyls et qui possède un acide carboxylique, se démarque des autres rhodamines par ses propriétés spectrales, sa stabilité et son bon rapport signal sur bruit in vivo.229 _{L’acide carboxylique présent sur la structure lui permet} notamment d’être conjugué aux biomolécules via un couplage peptidique. La rhodamine B, dérivée du TAMRA, possède des chaînes éthyliques à la place des méthyls. Son émission de fluorescence s’en trouve légèrement décalée vers le rouge.

La disponibilité commerciale de l’isothiocyanate de rhodamine B en fait un réactif de choix pour former un conjugué entre une iminosydnone et un fluorochrome à fluorescence rouge. Mais comme pour son analogue FITC, la réaction avec le sel d’iminosydnone ne permet pas l’obtention du produit désiré.

En revanche, en utilisant la méthode développée pour le chlorure de dansyl, nous avons pu conjuguer le dérivé chlorure de sulfonyl de la rhodamine B avec le sel d’iminosydnone 4a pour obtenir le produit attendu 56 avec un rendement de 28% (Figure 160).

229 _{M. R. Longmire, M. Ogawa, Y. Hama, N. Kosaka, C. A. S. Regino, P. L. Choyke, H. Kobayashi, Bioconjugate Chem.}

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Figure 160 : Réactions entre le sel d’iminosydnone 4a et des dérivés de rhodamine B.

Synthèse de sondes iminosydnones pro-fluorescentes substituées en position N6 et halogénées en position C4

L’extinction de fluorescence par effet d’atome lourd est un phénomène intéressant pour compléter notre étude de sondes iminosydnones pro-fluorescentes substituées en position N6.

Cet effet est une conversion inter-système, c’est-à-dire ici le passage d’un état singulet S1 à un état triplet T1 sans émission de rayonnement. L’efficacité de cette extinction est proportionnelle à Z4, (avec Z représentant le numéro atomique). Ce phénomène est illustré dans le Tableau 8.230

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F (Rendement quantique de fluorescence)

0.55

0.84

0.058

0.0016

<0.0005

Tableau 8 : Effet d’atome lourd en série naphtalène.230

Par ailleurs, l’atome lourd ne doit pas forcément se situer sur le noyau fluorescent pour avoir un effet d’extinction.231 _{Nous pouvons considérer l’utilisation de ce phénomène avec les iminosydnones} portant un fluorophore en position N–exocyclique puisque d’une part nous avons montré que la méthodologie de synthèse d’iminosydnones iodées et bromées en position C4 était robuste (cf. Chapitre I–1–D–Fonctionnalisation des iminosydnones en position C4) ; d’autre part parce qu’après réaction avec les alcynes cycliques, l’halogène n’est plus sur la même molécule que le fluorophore.

D’un point de vue synthétique, il n’est pas envisageable de réaliser les réactions d’halogénation sur les iminosydnones fonctionnalisées par les pro-fluorophores. En effet ceux-ci pourraient réagir avec les réactifs d’halogénation. Nous avons donc dû passer par l’intermédiaire halogéné portant un groupement Boc sur l’azote exocyclique. Après déprotection des produits 27b et 28 avec du TFA dans le dichlorométhane (Figure 161), le sel formé est engagé dans la réaction avec les électrophiles correspondants.

Devant le succès de la formation de l’isocyanate de fluorescéine dans l’acétone, nous avons conservé cette méthode pour le naphthalimide et la coumarine.

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Figure 161 : Formation des iminosydnones bromées pro-fluorescentes fonctionnalisées par une urée.

Nous avons donc obtenu les iminosydnones-urées correspondantes 59, 60 et 61 (Figure 161). Les dérivés fluorescéine et naphthalimide 60 et 61 sont isolés avec un rendement comparable aux produits portant un hydrogène en C4. Le rendement de la coumarine est inférieur à celui observé pour le composé 53. Cette différence provient probablement de la conversion de la 42 en isocyanate, étape que nous n’avons pas réalisée pour 53 puisque l’isocyanate était issu du réarrangement de Curtius de la coumarine azoture d’acyle.

Nous avons également synthétisé les dérivés bromé et iodés de l’iminosydnone-rhodamine 56 (Figure 162).

Figure 162 : Synthèse des iminosydnones bromée et iodée 62 et 63 ; *Réaction réalisée avec de la DMAP. Les conditions réactionnelles sont identiques à celles utilisées auparavant et permettent d’obtenir le composé 62 avec un rendement de 8% et le composé 63 avec un rendement de 12%.

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Pour conclure à propos des travaux sur les sondes iminosydnones fonctionnalisées en N6, nous avons dans un premier temps synthétisé des dérivés avec 5 fluorophores différents à partir du sel d’iminosydnone 4a. Pour compléter cette série et étudier l’effet des atomes lourds sur les propriétés optiques de nos sondes, nous avons dans un second temps synthétisé 5 autres iminosydnones portant ces fluorophores ainsi qu’un halogène en position C4 (Figure 163).

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Synthèse de double sondes iminosydnones, substituées en position N

et

N

La combinaison des deux types d’iminosydnones que nous venons de décrire ouvre la voie vers la génération d’un type de sondes très peu décrites, qui à partir d’une seule molécule donnent deux signaux distincts de fluorescence après activation. Elles peuvent permettre de suivre plusieurs phénomènes ou de visualiser plusieurs compartiments cellulaires à l’aide d’un seul outil.

Introduction bibliographique sur les sondes à double exaltation de