Résultats

Afin d’étudier les flores microbiennes par culture, celles-ci doivent tout d’abord être récupérées depuis une matrice pour être ensuite déposées sur des milieux nutritifs. Une fois que les microorganismes se sont développés sur ces milieux et ont été isolés, il est alors possible de les caractériser et de les identifier. La phase de prélèvement et de préparation de l’échantillon pour mise en culture est une étape très importante dans l’étude des communautés microbiennes. Dans cette étude, deux méthodes de prélèvements ont été testées :

- La première consiste en une mise en suspension des matériaux directement dans une solution de récupération. Cette méthode est notamment utilisée lorsque les échantillons sont récupérés sous forme particulaire. Cette technique destructive est particulièrement utilisée dans le cas des matériaux de construction, et permet d’avoir directement un extrait de la matrice d’intérêt. L’influence de différents paramètres a été évaluée, comme le temps d’agitation ou la concentration en détergent dans le milieu de récupération, afin d’optimiser la dispersion à partir des particules. L’efficacité de prélèvement/dispersion a été associée à la quantité d’UFC obtenus sur milieu de culture suivant ces différents facteurs.

- La seconde méthode était celle du prélèvement des microorganismes à la surface de matériaux fabriqués par film adhésif. Cette technique est une alternative non- destructive au prélèvement par grattage, permettant de récupérer les flores fongiques présentes à la surface du matériau sans abîmer visuellement ce dernier. Dans ce cas, le relargage des conidies fongiques adhérées sur le film en fonction du temps d’agitation a été étudié. Cela a ainsi permis d’évaluer si cette étape ne limite pas la récupération des microorganismes prélevés par le film.

D’autres techniques de prélèvement de surface peuvent être utilisées sur les matériaux et les surfaces, mais n’ont pas été appliquées dans cette étude. Les prélèvements par gélose contact ou écouvillonnage sont des options habituellement non destructives, mais l’humidification du matériau en terre crue lors du prélèvement pourrait conduire à une

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dégradation de celui-ci. La méthode de prélèvement par adhésif a été préférée à celle par moquette car cette dernière est peu adaptée au prélèvement de bactéries.

3.2.2.1. Optimisation de la méthode de récupération des microorganismes pour une mise en culture

A partir des matières premières, différents paramètres ont été analysés en vue d’améliorer le prélèvement des microorganismes contenus dans les FAC (Figure 3.5) ou dans la paille d’orge (Figure 3.6).

Pour les FAC, on peut observer que :

- Pour les différents temps d’agitations testés (5, 10 et 15 min), la concentration moyenne en bactéries est supérieure à celle des moisissures (2,5 ± 0,4 x104 UFC/g contre de 2,5 ± 0,2 x102 UFC/g, respectivement) (Figure 3.5.A).

- Une augmentation de la durée d’agitation n’a pas amélioré la récupération des cellules bactériennes et fongiques.

- La concentration moyenne en bactérie est de 2,5 ± 0,2 x104 UFC/g lorsque la concentration de détergent varie (Figure 3.5.B), indiquant que l’ajout de détergent n’a pas d’effet significatif sur la récupération des cellules et spores bactériennes.

- Cependant, l’utilisation d’un détergent à une concentration finale de 5% a permis d’améliorer légèrement la récupération de conidies fongiques, passant d’une concentration de 1,1 ± 0,2 x102 UFC/g à 2,6 ± 0,3 log10(UFC/g).

- Enfin, lors des essais avec différents ratios de quantités de FAC / milieu de récupération, les concentrations moyennes de bactéries et de moisissures sur l’ensemble des ratios sont respectivement de 2,1 ± 0,2 x104

UFC/g et de 1,9 ± 0,3 x102 UFC/g, aucun effet significatif n’ayant été observé dans les deux cas (Figure 3.5.C).

En ce qui concerne la paille, on note que :

- Le temps d’agitation influence, sur l’intervalle testé, la concentration en microorganismes. Pour les bactéries la concentration est comprise entre 3,7 ± 0,3 x104 UFC/g (à 0’) et 5,6 ± 1,1 x105 UFC/g (à 30’), et pour les moisissures elle est comprise entre 9 ± 0,1 x102 UFC/g (0’) et 6,73 ± 1,2 x103 UFC/g (30’) (Figure 3.6.A). Une durée d’agitation de 30 minutes améliore significativement (d’environ 1 log10) la récupération des spores bactériennes et des conidies fongiques.

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- La concentration en détergent n’a pas d’effet significatif sur la récupération des bactéries : 1,9 ± 0,1 x105 UFC/g de bactéries sont récupérées en moyenne sur l’ensemble des concentrations (Figure 3.6.B). Toutefois, dans le cas des champignons, l’addition de détergent améliore significativement la récupération des conidies, dont le nombre passe de 7,3 ± 0,9 x102 UFC/g (0%) à 5,4 ± 0,3 x103 UFC/g (1%), soit une augmentation de près de 1 log10.

- La figure 3.6.C présente les résultats issus des prélèvements à partir de paille en utilisant le Smasher™ comme outil d’agitation pour la dispersion. Cette technique d’agitation n’a pas eu d’impact significatif sur la récupération des bactéries dont la concentration moyenne sur l’ensemble des essais de 1,5 ± 0,3 x106

UFC/g.

- Cependant, la concentration en champignons a significativement augmenté entre 0% et 1% de détergent, passant de 1,3 ± 0,7 x103 UFC/g (à 2’- 0%) à 6,3 ± 1 x103 UFC/g (à 2’- 1%).

- Un allongement du temps de mélange à 5 minutes (au lieu de 2 minutes) ne présente pas d'effet sur la récupération des microorganismes.

- Finalement, le procédé de broyage à une concentration en détergent de 5% a permis de récupérer 1,3 ± 0,1 x106 UFC/g bactéries contre 2,1 ± 0,4 x105 UFC/g par la méthode de prélèvement par simple agitation. Il a donc amélioré la récupération des cellules et spores bactériennes d’environ un log10. Aucune différence significative n’a pu être observée pour les moisissures, avec 6,3 ± 1 x103 UFC/g par broyage et 5,1 ± 1,3 x103 UFC/g par agitation.

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Figure 3.5 : Unités formant colonie (moyennes ± écart-types ; trois essais indépendants en triplicats techniques) par gramme de FAC en fonction du temps d’agitation (A) (concentration en détergent finale 5 % ; ratio 1g/10mL), de la concentration en détergent (B) (temps d’agitation de 10 minutes ;

ratio 1g/10mL) ou du ratio masse de matériau / volume de milieu de récupération (C) (temps d’agitation de 10 minutes ; concentration en détergent finale 5 %).

Figure 3.6 : Unités formant colonie (moyennes ± écart-types ; trois essais indépendants en triplicats techniques) par gramme de paille en fonction du temps d’agitation (A) (concentration en détergent

finale 5 %), de la concentration en détergent (B) (temps d’agitation de 10 minutes) ou de la concentration en détergent et du temps d’agitation lors de l’utilisation du broyeur Smasher™ (C).

Ces premiers éléments nous ont permis de sélectionner des conditions optimales de traitement des échantillons : rapport masse/volume, concentration en détergent, technique (vortex ou Smasher™) et temps d’agitation (Tableau 3.3) :

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 Bactéries Moisissures log10( UF C/g) Temps d'agitation 0' 10' Bactéries Moisissures Concentration en détergent 0% 1% 5% 10% Bactéries Moisissures

Ratio FAC / milieu de récupération 1g/10mL 5g/20mL 25g/100mL 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 Bactéries Moisissures log10( UF C/g) Temps d'agitation 0' 10' 30' Bactéries Moisissures Concentration en détergent 0% 1% 5% 10% Bactéries Moisissures Smacher™ : 2'-0% 2'-1% 2'-5% 5'-5% A B C A B C * * * * *

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- Pour les FAC, une meilleure récupération des bactéries et des moisissures est obtenue lorsque le milieu de récupération contient une concentration finale en détergent de 5 %, et que les FAC sont agitées par agitateur durant 30 minutes. Les ratios masse/volume n’ont pas d’impact sur la récupération, et le choix s’est alors porté sur celui nécessitant le moins de matière, à savoir 1g/10mL.

- Les conditions optimales pour la paille consistent en un broyage de 2,5 g de paille par Smasher™ durant 2 minutes dans 100 mL de milieu de récupération à une concentration en détergent de 1 %.

- Au final, les mêmes conditions que pour les FAC ont été appliquées pour les échantillons in situ à cause de leur similarité en termes de composition.

Tableau 3.3 : Conditions optimales de traitement pour la récupération des microorganismes en fonction des matières premières.

Matières Ratio masse / volume Concentration en détergent Temps

d’agitation Type d’agitation

FAC 1g / 10mL 5 % 30 minutes Agitateur 300rpm

Paille 2,5g / 100mL 1 % 2 minutes Smasher™

Echantillons in situ

1g / 10mL 5 % 30 minutes Agitateur 300rpm

3.2.2.2. Optimisation de la récupération des spores fongiques à partir du film adhésif

L’influence du temps de vortex sur le relargage des microorganismes adhérés dans la solution de récupération (concentration finale en détergent de 5 %) a été évaluée en agitant par vortex durant 5 secondes ou 5 à 10 minutes un adhésif avec une quantité connue de conidies déposées à sa surface (Figure 3.7). Quand l’adhésif n’est agité par vortex que quelques secondes, la quantité de spores récupérées est de 3,6 ± 0,5 x105 UFC, alors que 8,7 ± 2,8 x106 UFC avaient été déposées sur l’adhésif. Avec un temps d’agitation plus long (5 ou 10 minutes), le recouvrement des conidies augmente significativement, i.e. d’environ 1 log10, et 2,8 ± 0,5 x106 UFC sont récupérées. Aucune différence significative n’est observée entre les temps d’agitation 5 et 10 minutes, ce qui suggère que le temps d’agitation n’a plus d’impact sur la récupération des conidies adhérées. Un temps de 5 minutes de vortex semble suffisant

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pour décrocher les conidies adhérées, bien que le taux de recouvrement final ne soit que d’environ 30 %.

Figure 3.7 : Unités formant colonie (moyennes ± écart-types ; trois essais indépendants en triplicats techniques) d’A.brasiliensis recouvrées depuis le film adhésif en fonction de la durée d’agitation.