Méthodes d’analyse par empreinte génétique

Il est possible de caractériser une communauté microbienne en se basant sur une empreinte génétique. Ce type de méthode permet l’observation de la structure, la diversité ainsi que la dynamique de population au sein d’un écosystème microbien. Le principe consiste à suivre des variations génétiques d’un gène témoin dans une communauté, en observant l’ensemble des variants présents (séquences d’ADN provenant d’une même région mais ayant subi des mutations différentes selon les organismes au cours de l’évolution). Pour cela, le gène d’intérêt est amplifié par PCR, puis les différents amplicons sont discriminés suivant différentes techniques. Les marqueurs phylogénétiques peuvent être soit des gènes universels comme les gènes ribosomiques (16S pour les bactéries et 18S pour les eucaryotes), soit des gènes plus spécifiques, impliqués par exemple dans certains processus métaboliques. Les résultats des méthodes d’analyse par empreinte génétique se présentent généralement sous la forme de profils de bandes sur un gel de migration. La variabilité des séquences permet une séparation des amplicons lors de la migration, et ensuite une comparaison sur l’absence / présence de bandes entre les différents échantillons, chaque bande correspondant à une séquence particulière. Le développement de ces méthodes, rapides et peu coûteuses, a ainsi permis d’avoir des informations sur la diversité, la richesse et la composition des communautés microbiennes. Différentes méthodes d’empreinte génétique peuvent être distinguées (Nocker et al., 2007) :

Electrophorèse sur gel en gradient dénaturant (DGGE)

La DGGE est une technique de caractérisation moléculaire des communautés utilisée depuis les années 90. Cette méthode permet de faire migrer les amplicons PCR par électrophorèse en présence d’un agent chimique dénaturant plus facilement les liaisons AT que CG, discriminant ainsi les séquences sur le critère de leur composition (Muyzer and Smalla, 1998; Muyzer et al., 1993). Dans le cas de la TGGE (Electrophorèse sur gel à gradient de température), l’agent dénaturant chimique est remplacé par un gradient de température.

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Polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP)

La RFLP permet une identification des individus d’une population en se basant sur le polymorphisme des différentes séquences d’ADN étudiées au niveau de leurs sites de restriction. Après l’amplification PCR d’un marqueur génétique, les amplicons sont digérés par une enzyme de restriction et migrent sur un gel par électrophorèse. Les séquences d’une région donnée pouvant avoir des sites de restriction ou des tailles de séquence entre chaque site de restriction différents d’un genre ou d’une espèce à l’autre ; ces variations observées sur le profil seront un indicateur de la diversité microbienne.

Une amélioration de cette technique, le polymorphisme de longueur des fragments de restriction terminaux (T-RFLP), consiste à ajouter un fluorochrome fixé sur une ou deux amorces lors de la PCR, permettant alors une révélation par fluorescence des parties terminales des fragments (Liu et al., 1997). Il est ainsi possible de dépasser certaines limites de la RFLP, comme la faible sensibilité et résolution génotypique, tout en étant moins fastidieuse à mettre en place. En comparant une communauté microbienne du sol par DGGE et par T-RFLP, Tiedje et al. (1999) ont montré une sensibilité 5 fois supérieure pour cette dernière.

Polymorphisme de conformation des simples brins (SSCP)

Cette méthode est principalement utilisée pour la recherche et la détection de mutations et d’allèles dans des séquences d’ADN, mais a également été adaptée pour l’étude des communautés microbiennes (Lee et al., 1996; Schwieger and Tebbe, 1998). Les amplicons sont dénaturés en simples brins et déposés sur gel non-dénaturant. Les simples brins d’ADN adoptent une structure 3D particulière (structure secondaire), dépendante de la séquence, et celle-ci influence leur mobilité lors de la migration dans le gel. Il est alors possible de différencier des fragments de même poids moléculaire sur la base de ces différences de structures secondaires et donc de séquence. La différenciation des fragments peut également être réalisée par électrophorèse capillaire.

Analyse automatisée de l’espace intergénique de l’ADN ribosomal (ARISA)

La méthode de génotypage ARISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) se base sur l’analyse des régions intergéniques ribosomales pour évaluer les communautés bactériennes et fongiques. Ces régions sont généralement plus variables que les régions

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ribosomales codantes, et permettent ainsi une meilleure identification des sous-types de certaines souches bactériennes ou la différentiation d’espèces très proches phylogénétiquement. Ces régions sont amplifiées par PCR et les amplicons sont séparés selon leur taille. L’utilisation d’amorces fluorescentes permet de mesurer une intensité relative à la quantité de séquences pour chaque groupe de taille de séquences proches et par extension chaque ensemble taxonomique proche (espèce, genre) (Danovaro et al., 2006; Fisher and Triplett, 1999). Cet outil s’est révélé performant pour l’analyse de communautés nécessitant une résolution fine et précise (Jensen et al., 1993).

L’ensemble de ces approches présente plusieurs limitations. Tout d’abord, puisque ce sont des profils de bandes et non des régions d’ADN séquencées, elles ne permettent pas une réelle identification taxonomique des individus présents dans la communauté. Il faut nécessairement effectuer dans un second temps le séquençage de chaque bande si l’identification des genres et espèces est recherchée. Ces méthodes ne permettent d’observer que les taxons les plus abondants dans la communauté, les plus rares n’étant pas suffisamment amplifiés pour être détectés, et cela conduit donc à une faible résolution phylogénétique (Dunbar et al., 2001; Muyzer and Smalla, 1998). De plus, certaines espèces peuvent être difficiles à discriminer suivant les méthodes, comme le genre Staphylococcus dans le cas du SSCP, et la présence de plusieurs copies différentes d’une région cible au sein d’un même génome peut biaiser la représentativité quantitative du profil obtenu. Comme toutes les méthodes basées sur l’amplification PCR, des erreurs dans les séquences et donc dans les profils peuvent apparaitre. Enfin, il est assez compliqué en utilisant des profils de bandes sur gels de comparer les résultats de différentes études. Ces méthodes ne permettent donc pas d’obtenir des informations précises sur les échantillons environnementaux étudiés, mais un profil général des principaux organismes présents et de leur diversité.