Résultats et Discussion - Localisation de MTM1 fusionnée à la GFP

La construction GFP-MTM1^WT (fusion en N-ter) présente essentiellement une fluorescence diffuse dans le cytoplasme même si quelques rares structures ponctuées ont été observés (Figure 70A). De manière intéressante, la construction MTM1 fusionnée à la GFP à son extrémité C-terminale, présente une fluorescence cytoplasmique beaucoup plus faible et est localisée au niveau de points adjacents à la vacuole, colocalisant partiellement avec la sonde FYVE-DsRed (Figure 69) et le FM4-64 (Figure 70B).

Enfin, la construction MTM1ΔPH-GRAM délétée pour les 160 premiers acides aminés correspondant au domaine PH-GRAM, et fusionnée en C-ter à la GFP est très souvent localisée au niveau d’un point unique (parfois deux) très brillant dans la cellule (Figure 70B) et colocalise avec la sonde FYVE-DsRed (Figure 69).

Figure 70 : Observation microscopique à fluorescence de levures exprimant des formes de MTM1 fusionnées à la GFP. A) GFP-MTM1

(fusion en N-ter) présente une localisation diffuse dans le cytoplasme ainsi que dans quelques rares structures en point. B) La construction

MTM1-GFP est localisée au niveau de structure ponctuées adjacentes à la vacuole. MTM1ΔPH-GRAM-GFP ainsi que le domaine PH-GRAM(aa 1-160)-GFP montrent des localisations intracellulaires similaires consistant en un ou deux points très brillants colocalisant partiellement avec des structures ponctuées positives pour le 64. Le marquage au FM4-64 a été réalisé pendant un temps court afin de mieux visualiser les structures endosomales.

J’ai par ailleurs analysé la localisation, en fusion GFP C-ter, du domaine PH-GRAM de MTM1^WT. La fluorescence est localisée au niveau de structures en point colocalisant partiellement avec le FM4-64 (Figure 70B). A noter que pour cette observation microscopique, j’ai réalisé un marquage au FM4-64 très court (5 minutes) afin de visualiser les compartiments endosomaux (Figure 70B). En effet, à des temps plus longs, la fluorescence du FM4-64 est entièrement internalisée et ne marque que la membrane vacuolaire.

La fluorescence cytoplasmique diffuse de la construction GFP-MTM1WT (fusion en N-ter) ne corrèle pas avec la distribution membranaire de la protéine MTM1WT non-étiquetée dans mes analyses par fractionnement subcellulaire. J’ai donc vérifié la distribution de la construction GFP-MTM1WT en fractionnement subcellulaire. Les résultats montrent que dans les mêmes conditions, MTM1^WT non-étiquetée est bien distribuée dans les fractions membranaires tandis qu’un important pool de GFP-MTM1^WT est présent dans la fraction cytosolique S100.

DISCUSSION

Ces résultats montrent que la présence d’une étiquette GFP en fusion N-terminale avec MTM1^WT (GFP-MTM1^WT) induit une relocalisation de la protéine de fusion dans la fraction cytoplasmique. Cette observation est confirmée d’une part par la fluorescence diffuse en microscopie et d’autre part par fractionnement subcellulaire. En effet, alors que la protéine non-étiquetée est distribuée dans les fractions membranaires, une proportion significative de GFP-MTM1 est détéctée dans la fraction cytoplasmique S100.

Figure 71 : Fractionnement subcellulaire d'extraits protéiques de levures produisant GFP-MTM1 et MTM1 non étiquetée. MTM1WT non-étiquetée est distribuée dans les fractions P13 et P100, comme décrit plusieurs fois dans ce manuscrit. En revanche la construction GFP-MTM1WT est partagée entre la fraction P13 et la fraction cytosolique S100.

Partie II : Résultats et Discussion - Localisation de MTM1 fusionnée à la GFP

De manière intéressante, la proportion de MTM1 détectée dans la fraction P100 est relativement inchangée entre la protéine non-étiquetée et GFP-MTM1^WT. Il est donc possible que la présence d’une étiquette GFP relocalise spécifiquement un sous-groupe de MTM1 de la fraction P13 vers le cytosol.

Il est également important de souligner que les phénotypes vacuolaires sont distincts entre les levures produisant GFP-MTM1^WT et MTM1^WT-GFP. En effet, les cellules produisant la myotubularine fusionnée à la GFP C-terminale présentent une proportion de larges vacuoles plus élevée que celle observée chez les levures produisant GFP-MTM1^WT. Ceci suggèrent que la fusion GFP en N-ter perturbe l’activité phosphatase de MTM1^WT, probablement en raison de sa relocalisation dans le cytoplasme, où la protéine GFP-MTM1^WT n’est pas en contact avec ses substrats lipidiques, le PtdIns3P et le PtdIns(3,5)P2.

Le dernier point concerne les myotuburines MTM1 tronquées fusionnées en C-ter à la GFP. La localisation de ces deux constructions (MTM1^ΔPH-GRAM-GFP et PH-GRAM^MTM1-GFP) présente d’inexplicables similarités. En effet, l’absence du domaine PH-GRAM induit une fluorescence forte au niveau de structures ponctuées colocalisant partiellement avec des marqueurs endosomaux (FYVE-DsRed et FM4-64) suggérant que le domaine PH-GRAM est facultatif pour localiser MTM1 aux endosomes. Cette observation est surprenante dans la mesure où le domaine PH-GRAM a été identifié comme étant impliqué dans la liaison avec les substrats de la myotubularine.

D’un autre côté, le domaine PH-GRAM seul (acides aminés 1 à 160) affiche une fluorescence similaire au niveau de compartiments colocalisant partiellement avec des marqueurs endosomaux. Ces résultats suggèrent donc que l’adressage endosomal de MTM1 dépend de deux domaines qui s’auto-suffisent : le PH-GRAM et le domaine catalytique, sachant que ces deux domaines sont capables de lier les PPIn in vitro.

En d’autres mots, ces observations envoient trois messages difficiles à connecter : 1) le domaine PH-GRAM seul est suffisant pour la localisation endosomale, 2) le domaine PH-GRAM n’est pas indispensable pour la localisation endosomale de MTM1 ^ΔPH-GRAM et 3) un possible encombrement stérique par la GFP proche du domaine PH-GRAM induit la relocalisation d’une partie de GFP-MTM1^WT dans le cytoplasme.

Pour conclure, des analyses complémentaires seront nécessaires pour mettre au clair l’implication du domaine PH-GRAM dans la localisation de MTM1^WT. Il serait notamment judicieux d’identifier avec plus de précision les compartiments dans lesquels ces myotubularines s’accumulent.

Le mutant MTM1^S376N de myotubularine a été analysé suite à l’hypothèse d’un possible effet « substrat-trap » du mutant MTM1^C375S. Le mutant MTM1^S376N a été caractérisé comme étant catalytiquement inactif et la mutation de la Sérine en position 376 en une Asparagine génére un encombrement stérique dans la poche catalytique rendant peu probable la possibilité de piéger les substrats (Figure S5 de l’article).

J’ai par conséquent réalisé les mêmes analyses à partir de MTM1S376N que celles réalisées pour les autres myotubularines. Les levures SEY6210 ymr1Δ ont été transformées soit avec un plasmide pVV200_MTM1S376N soit avec un plasmide pVV204_MTM1S376N. Les niveaux de production de la protéine dans S. cerevisiae sont comparables à ceux des mutants inactifs MTM1^C375S et MTM1^R421Q. Cette observation est en adéquation avec le fait que les myotubularines enzymatiquement inactives sont produites en plus grandes quantité dans la levure que les myotubularines actives.

En microscopie, la surproduction de MTM1^S376N n’induit pas d’élargissement vacuolaire et les levures produisant MTM1^S376N présentent des phénotypes comparables aux levures produisant les mutants inactifs MTM1^C375S et MTM1^R421Q.

Figure 72 : Analyse de la production de différentes formes de MTM1 dans S. cerevisiae SEY6210 ymr1Δ. Les

gènes codant pour les différentes formes de MTM1 ont été placé sous le contrôle d’un promoteur repressible à la tetracycline TetO dans le plasmide centromérique CEN (pVV204, 1-3 copies par cellule). Dans le plasmide épisomique à haut nombre de copies, MTM1 a été placé sous le contrôle d’un promoteur fort PGK1 (2m). Les protéines MTM1 ont été détectées à l’aide d’anticorps anti-MTM1 1G6. Les protéines sont produites à la taille attednues (70kDa). La protéine Pgk1, la phosphoglycérate kinase de levure, sert ici de contrôle de charge.