L’endocytose en phase fluide n’est pas affectée par MTM1

L’endocytose en phase fluide, c’est-à-dire non relayée par des récepteurs membranaires, peut être suivie par le biais d’un colorant fluorescent appelé Lucifer Yellow (LY) s’accumulant dans le lumen de la vacuole. Le LY est incapable de traverser les membranes biologiques et son accumulation dans la vacuole dépendra donc du transport vésiculaire. En condition normale, le colorant est internalisé non spécifiquement par endocytose en même temps qu’une invagination se forme. Le LY sera donc retrouvé dans le lumen des vésicules d’endocytose à destination de la

Figure 65 : Analyse de la voie du trafic de l’uracile perméase Fur4-GFP dans S. cerevisiae. Des cellules

SEY6210 ymr1Δ transformées avec le plasmide pVV200 vide ou codant pour les différentes formes de MTM1

ont été cotransformées avec un veteur d’expression de Fur4 fusionnée à la GFP et sous le contrôle d’un promoteur inductible GAL1. Après 90 minutes d’induction de Fur4-GFP avec du galactose, la néosythèse est

stoppée par ajout de glucose. Au temps 0 minutes, avant ajout de cycloheximide, Fur4-GFP est normalement localisée à la membrane plasmique dans toutes les cellues. Après 60 minutes, les myotubularines actives présentent un retard de tri au niveau de structures ponctuées ressemblant aux endosomes.

la réaction est stoppée par ajout d’azide de sodium (NaN3), lavées et observées par microscopie à fluorescence.

Afin de déterminer si la présence des myotuburines peut altérer le processus d’endocytose en phase fluide, j’ai analysé la fluorescence dans des souches SEY6210 ymr1Δ transformées soit avec un plasmide pVV200 vide ou codant pour les différentes myotubularines.

Chez la levure transformée avec le plasmide vide, la fluorescence est normalement localisée dans le lumen de la vacuole. En présence des myotubularines MTM1WT, MTM1C375S, MTM1V49F ou MTM1R69C, la même fluorescence vacuolaire a été observée en comparaison aux levures transformées avec le plasmide vide. L’unique différence réside dans la morphologie vacuolaire des souches produisant une myotubularine active (Figure 66).

Figure 66 : Analyse de l'endocytose en phase fluide à l'aide du marqueur fluorescent Lucifer Yellow. Le LY

est un colorant fluorescent s’accumulant dans le lumen de la vacuole lorsque les cellules sont incubées avec ce marqueur. Le LY est incapable de traverser les membranes biologiques et son accumulation dans la vacuole dépendra donc du transport vésiculaire. La surexpression de MTMT1WT ou des différents mutants n’altère pas le processus d’endocytose en phase fluide puisque le LY est correctement délivré dans le lumen de la vacuole, indépendamment de l’activité phosphatases de mutants MTM1.

Partie II : Résultats et Discussion - Effets de la surexpression de MTM1 dans S. cerevisiae sur diverses voies du trafic dépendants des PPIn

DISCUSSION

L’absence de phénotype concernant l’endocytose en phase fluide, visualisée ici par l’internalisation du marqueur fluorescent Lucifer Yellow, suggèrent que les myotubularines actives ou inactives n’ont pas d’influence majeure sur cette voie cellulaire. Le matériel soluble extracellulaire peut être correctement délivré vers la vacuole pour dégradation malgré la surproduction de myotubularines enzymatiquement actives. Ceci montre donc que le défaut d’adressage de Fur4-GFP n’est pas du à un défaut de fusion des endosomes avec la vacuole, mais bien à une altération du tri protéique au niveau des endosomes tardifs (ou MVB), sachant que ce tri dépend du PtdIns3P et du PtdIns(3,5)P2.

Figure 67 : Schéma récapitulatif des différents marqueurs utilisés dans cette étude. En rouge, le FM4-64 est

une colorant lipophile, marquant les membranes biologiques. Ajoutés au milieu de culture, il marque la mambrane plasmique puis est internalisé pour décorer la membrane de la vacuole en passant pas le système endosomal. En

jaune , le Lucifer Yellow est un colorant incapable de traverser les membranes biologiques. De ce fait, il sera

internalisé dans les vésicules d’endocytoses et marquera le lumen de la vacuole en fin de parcours. En violet, la protéine CPY (Carboxypeptidase Y) est une protéase synthétisée dans le reticulum endoplasmique. CPY subit des étapes successives de maturation dans l’appareil de Golgi puis dans le réticulum endoplasmique avant de rejoindre le lumen de la vacuole. En vert, l’uracile perméase Fur4 est une protéine transmembranaire sécrétée à partir de

l’appareil de Golgi vers la membrane plasmique. En condtion de stress, Fur4 est internalisée et est triée par le système endosomal pour être libérée dans le lumen de la vacuole.

Le phénotype « large vacuole » est très prononcé lorsque des levures SEY6210 ymr1Δ produisent des formes actives de MTM1, telles que MTM1WT et MTM1R69C. Nous avons montré que ces deux myotubularines sont actives in vivo dans la levure (Figure 4 de l’article). MTM1R69C est cependant impliquée dans la XLCNM bien que son activité phosphatase ne soit pas affectée.

Suite à un stress hyperosmotique, les levures transformées avec un plasmide pVV200 vide présentent une vacuole fragmentée, résultant de l’activation de la kinase Fab1 générant le PtdIns(3,5)P2. L’élévation de PtdIns(3,5)P2 est à l’origine de la fragmentation de la vacuole. De la même manière les levures produisant les formes MTM1^WT et MTM1^R69C, responsables d’un élargissement vacuolaire en milieu riche, affichent une vacuole fragmentée en condition de choc osmotique.

Dans cette expérience, j’ai cherché à déterminer la capacité de MTM1^WT et MTM1^R69C à permettre la récupération des morphologies vacuolaires après un choc osmotique. Je souhaitais de cette manière identifier une possible différence d’activité sur un temps court. En effet, les dosages des PPIn in vivo ou les dosages en masse ont été réalisé à partir de cellules en culture pendant plusieurs heures. Une différence très légère en terme d’activité phophatase ou de recrutement, en condition de surproduction de MTM1, sur des temps longs, pourrait passer inaperçu. De plus, le PtdIns(3,5)P2, après un choc osmotique, peut augmenter de plus de huit fois sa concentration en condition basale (Bonangelino et al., 2002). Cette augmentation massive pourrait permettre de détecter une différence entre MTM1^WT et MTM1^R69C dans leur capacité à réduire le PtdIns(3,5)P2 à des niveaux suffisamment faibles pour induire le phénotype « large vacuole ».

J’ai donc observé la morphologie vacuolaire des levures contrôles (plasmide vide), produisant MTM1^WT ou MTM1^R69C après un choc osmotique de 10 minutes en présence de 0.9M de NaCl. Comme attendu, les vacuoles des trois souches de levure sont fragmentées. Après lavage et transfert des cellules en milieu riche, les levures produisant les formes MTM1^WT et MTM1^R69C montrent, après 10 minutes en milieu riche des vacuoles comparables à celles avant le choc osmotique (Figure 68).

Partie II : Résultats et Discussion - Effets de la surexpression de MTM1 dans S. cerevisiae sur diverses voies du trafic dépendants des PPIn

Figure 68 : Récupération de la morphologie vacuolaire après un choc osmotique. En milieu riche, les

levures produisant des formes actives de MTM1 présentent des phénotypes « larges vacuoles » en corrélation avec l’activité phosphatase des myotubularines MTM1. En présence d’une forte concentration en NaCl (0.9 M pendant 10 minutes), les vacuoles sont fragmentées. Après lavages des cellules pour éliminer le NaCl, 10 minutes suffisent pour récupérer le phénotype « larges vacuoles ».

DISCUSSION

Les capacités des myotubularines MTM1^WT et MTM1^R69C à récupérer un phénotype « large vacuole » sont similaires 10 minutes après transfert d’un milieu NaCl vers un milieu riche. Néanmoins, au vue de la quantité et de la stabilité des myotubularines dans S. cerevisiae, il est

possible que le recrutement des myotubularines au lieu où le PtdIns(3,5)P2 est produit par Fab1 soit trop rapide pour voir une différence entre MTM1^WT et MTM1^R69C. Il serait peut-être plus judicieux de réaliser la même expérience en utilisant un plasmide pVV204 (centromérique, 1-3 copies par cellule) dans la mesure où ce plasmide permet la production des myotubularines en plus faible quantité.