Les niveaux de MTM1s sont régulés dans S. cerevisiae

Lors de l’expression hétérologue de MTM1 dans S.cerevisiae, nous avons pu observer des différences dans les niveaux de MTM1 détéctés en Western Blot (cf. article). En effet, de manière hautement reproductible, les niveaux de MTM1^C375S et de MTM1^R421Q sont plus élevés que ceux de MTM1^WT, MTM1^V49F, MTM1^R69C et MTM1^N180K. Cette tendance corrèle avec l’activité phosphatase des différents mutants puisque plus une myotubularine est active dans S. cerevisiae, moins elle est détectée en Western Blot.

Notre méthode pour mesurer la concentration de nos cultures est basée sur la turbidimétrie. En d’autre terme, nous mesurons l’absorbance des cellules en suspension à une longueur d’onde de 600nm à l’aide d’un spectrophotomètre. Néanmoins la surexpression d’une myotubularine active induit une augmentation du volume vacuolaire mais également une légère augmentation de la taille des cellules. Par conséquent, il est possible qu’à densité optique (DO600nm) égale, les cultures contenant des cellules plus volumineuses, exprimant par exemple une myotubularine active, soient en réalité moins denses que les cultures contenant des cellules de plus petites tailles. Dans cette hypothèse, les différences de niveaux de MTM1 détéctés seraient donc dues à une différence de quantité de protéines déposées sur gel. Cette hypothèse semble peu probable car dans ce cas le niveau de la phosphoglycérate kinase (Pgk1) une enzyme clef de la glycolyse également analysé sur le même blot devrait suivre celui de MTM1 ce qui n’est pas le cas (Figure 1 de l’article). Cependant afin d’exclure totalement cette possibilité, les concentrations des différentes cultures ont été évaluées à l’aide d’une cellule de numération de type Neubauer. Puis un nombre identique de cellules ont été lysées et analysées par Western Blot. Les résultats (non montrés ici) confirment que les niveaux des différents mutants MTM1 dépendent de leur activité phosphatase puisque les mêmes différences entre les niveaux de myotubularines actives et ceux de myotubularines inactives ont été mises en évidence à quantité égale de cellules. Par ailleurs, ces différences très nettes alors que les niveaux de Pgk1 (Phosphoglycérate kinase 1) demeurent constants sont un argument

Partie II : Résultats et Discussion - Les niveaux de MTM1s sont régulés dans S. cerevisiae

supplémentaire en faveur d’une régulation des niveaux de myotubularines dans S. cerevisiae dépendante de leurs activités phosphatase.

Il est par ailleurs très peu probable que ces différences soient dues à des différences dans les niveaux de transcription puisque ces observations ont été faites en présence de deux plasmides différents portant les cDNA des différents mutants MTM1 sont le contrôle de deux promoteurs différents : le promoteur fort de levure PGK (plasmide pVV200) et le promoteur bactérien TetO régulable à la tétracycline (pVV204). De plus, ces observations ont été faites dans les cellules mutantes ymr1D et dans la souche sauvage de levure, ils ne dépendent donc pas d’une possible hétéro-dimérisation entre Ymr1 et MTM1.

1. Les MTM1s sont stables dans S. cerevisiae

En fait, des niveaux différents de MTM1 peuvent s’expliquer de plusieurs manières. D’une part, il peut s’agir d’une différence dans les niveaux de production des protéines ou d’autre part, dans les niveaux de stabilité et de dégradation des protéines. J’ai entrepris d’examiner la stabilité de trois myotubularines présentant les plus grandes différences de niveaux de protéines : MTM1^WT, MTM1^C375S et MTM1^R69C. Pour cela, j’ai analysé les niveaux de MTM1 au cours du temps après ajout dans les cultures de cycloheximide à une concentration de 100µg/mL. Le cycloheximide est un inhibiteur de la biosynthèse protéique dans les cellules eucaryotes. Ainsi, en absence de néosynthèse de protéines MTM1, il est possible d’observer la stabilité au cours du temps des protéines synthétisées avant l’ajout de cycloheximide. Le mode d’action du cycloheximide n’est que partiellement compris mais il serait impliqué dans un blocage de la traduction (Schneider-Poetsch et al., 2010).

Les résultats ne montrent pas de différences notables dans la stabilité des mutants MTM1^R69C et MTM1^C375S par rapport à MTM1^WT 3h après l’addition de cycloheximide. Les trois myotubularines sont toujours détéctables 3h après le blocage de la biosynthèse protéique en quantités quasi-équivalentes aux quantités initiales (Figure 42).

Figure 42 : Stabilité des myotubularines après blocage de la néosynthèse protéique par le cycloheximide. MTM1 a été

inactives dans S. cerevisiae

En absence de néosynthèse de MTM1, les différents mutants MTM1 sont remarquablement sables dans S. cerevisiae. Si la stabilité n’explique pas les différences de niveaux de MTM1, il est possible que les différents mutants MTM1 soient dégradés selon leur activité phosphatase afin d’éviter une possible cytotoxicité. J’ai par conséquent analysé les niveaux de ces trois mutants MTM1 dans des mutants soit du protéasome, soit de protéases vacuolaires. Les levures pre1-1

pre2-1 sont mutées dans les sous-unités β4 et β5 du protéasome 20S respectivement et sont

déféctueuses dans la dégradation dépendante du protéasone. Les mutants pep4Δprb1Δprc1Δcps1Δ sont mutés pour les quatres protéases vacuolaires principales : la protéinase A, la protéinase B, la carboxypeptidase Y (CPY) et la carboxypeptidase S (CPS) respectivement, responsables de la dégradation des protéines dans le lumen de la vacuole (Achstetter et al., 1984).

Dans ces deux souches mutantes, les mêmes différences de niveaux de MTM1 détectées ont été observées. Les processus de dégradation faisant intervenir le protéasome ou les protéases vacuolaires n’expliquent donc pas les variations de niveaux de MTM1 détectées par WB.

Figure 43 : Niveaux de MTM1 détectés par WB dans des mutants A) du protéasome ou B) des quatre protéases vacuolaires principales. MTM1 a été détectée par western blot avec un anticorps anti-MTM1

monoclonal de souris.