L’association aux membranes de MTM1 ne dépend pas des PPIn

MTM1 ne possède pas de domaine transmembranaire et pourtant chez S. cerevisiae elle est majoritairement localisée dans les fractions associées aux membranes (Figure 53). Dans des cellules humaines, la fraction de MTM1 qui est localisée aux membranes endosomales s’associe au complexe kinase VPS15/VPS34 qui synthétise le PtdIns3P (Cao et al., 2007). De la même façon, chez S. cerevisiae, la localisation de MTM1 dans les fractions membranaires P13 et P100 pourrait être due à l’association de l’enzyme au sein d’un complexe impliquant d’autres kinases et/ou

Figure 54 : Distribution de MTM1 sauvage dans S. cerevisiae en condition de choc osmotique. Un stress osmotique (0.9 M NaCl

pendant 10 minutes) ne modifie pas la distribution de MTM1 sauvage dans S. cerevisiae.

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j’ai déterminé la distribution de MTM1 sauvage par fractionnement subcellulaire dans différentes souches de levures (BY4742) déletées pour les gènes codant pour les kinases Vps34 et Fab1, pour la phosphatase Fig4 ou pour l’activateur Vac14 (Fig. 2). En effet, l’absence du partenaire de MTM1 serait susceptible de délocaliser MTM1 des membranes vers le cytoplasme. Il est important de préciser que la surexpression de MTM1WT dans les levures BY4742 et BY4742 trp1Δ ymr1Δ induit un élargissement vacuolaire similaire à celui observé dans le fond génétique SEY6210.

Dans les levures sauvages de la souche BY4742, MTM1^WT est aussi distribuée dans les fractions membranaires P13 et P100, comme dans la levure sauvage souche SEY6210. L’analyse de la distribution de MTM1^WT dans les différentes levures mutantes pour des enzymes-clés du métabolisme des PPIn montre que la myotubularine a une distribution semblable chez les levures mutantes et chez la souche sauvage BY4742, à savoir dans les fractions P13 et P100.

Figure 55 : Distribution de MTM1 WT dans différents mutants du métabolisme des PPIn. Analyse de la

distribution de MTM1 sauvage dans des levures BY4742 déletées pour des gènes impliqués dans la voie de synthèse du PtdIns3P et du PtdIns(3,5)P2. Dans la levure sauvage, MTM1 est localisée dans les fractions associées aux membranes. Dans les mutants de délétion, la distribution de MTM1 est similaire à la levure WT suggérant d’une part que l’absence de ces interactants potentiels n’altère pas la localisation à la membrane de la protéine MTM1 et d’autre part qu’un désordre dans les niveaux de PPIn n’affecte pas sa distribution dans les fractions associées aux membranes.

DISCUSSION

MTM1 ne possède pas de domaine transmembranaire et est majoritairement localisée dans le cytoplasme des cellules humaines. De manière surprenante, chez S. cerevisiae, les expériences de fractionnement subcellulaire montrent une distribution de MTM1 majoritairement dans les fractions associées aux membranes (P13 et P100). En outre, bien que les formes mutantes MTM1^V49F et MTM1^R69C soient modifiées dans le domaine PH-GRAM de reconnaissance des substrats lipidiques, elles ne montrent pas de différence de distribution, tout comme les mutant MTM1N180K et MTM1R421Q.

Partie II : Résultats et Discussion - MTM1 est recrutée aux membranes dans S. cerevisiae

De plus, il est peu probable que la distribution des myotubularines MTM1 dans les fractions membranaires soit due à l’activité phosphatase, en effet le mutant catalytique inactif MTM1^C375S est également retrouvé dans les fractions associées aux membranes P13 et P100. Pourtant les analyses d’interaction lipidique in vitro réalisées au laboratoire ont montré que MTM1 sauvage lie le PtdIns3P et le PtdIns(3,5)P2, contrairement au mutant MTM1^C375S pour qui l’affinité pour le PtdIns(3,5)P2 est fortement diminuée (Figure 46).

Par ailleurs, l’augmentation du pool membranaire de PtdIns(3,5)P2 en réponse à un choc osmotique (0.9 M NaCl pendant 10 min) (Figure 2 de l’article et Figure 52) ne modifie pas le profil en fractionnement subcellulaire puisque celui-ci présente une distribution similaire de MTM1^WT. A cela s’ajoute le fait que malgré la délétion du gène codant pour la kinase Vps34 et donc en l’absence de synthèse de PtdIns3P (et indirectement en l’absence de PtdIns(3,5)P2 synthétisé à partir du PtdIns3P), les différentes myotubularines demeurent associées aux membranes. Ce résultat est confirmé par les résultats identiques obtenus avec la souche fab1D qui

ne synthétise plus de PtdIns(3,5)P2. En outre, l’absence de l’activateur Vac14 (qui sert également de plate-forme de recrutement pour tous les effecteurs du PtdIns(3,5)P2) ou de la phosphatase Fig4 n’affecte pas la distribution subcellulaire de MTM1 qui est semblable à celle observée pour la levure BY4742 sauvage (Figure 55).

Ces résultats confirment d’une part que la localisation aux membranes de MTM1, chez S.

cerevisiae, est indépendante aussi bien du PtdIns3P que du PtdIns(3,5)P2. D’autre part, chez S.

cerevisiae, la localisation membranaire de MTM1 ne requiert pas la présence des protéines

Vps34, Fab1, Vac14 ou Fig4. La localisation membranaire des myotubularines MTM1 chez S.

cerevisiae ne peut donc pas s’expliquer simplement par une reconnaissance de MTM1 par ses

substrats membranaires, le PtdIns3P et le PtdIns(3,5)P2, ou par une interaction avec Vps34, Fab1, Vac14 ou Fig4.

Pour conclure, la distribution subcellulaire de MTM1 dans les fractions membranaires P13 et P100 n’exclut pas des changements plus fins entre la localisation des myotubularines MTM1^WT ou mutantes. En effet, une redistribution de MTM1 entre les endosomes précoces (enrichis en PtdIns3P) et tardifs (enrichis en PtdIns(3,5)P2) se traduirait, en fractionnement subcellulaire, par la même distribution dans la fraction P100. Je ne peux pas exclure non plus qu’une partie des protéines MTM1 puisse former des aggégats et que ces structures soient suffisamment denses pour qu’elles soient distribuées dans les fractions membranaires.

MTM1 dans S. cerevisiae

MTM1 est principalement cytoplasmique dans les cellules humaines mais une activation de la RhoGTPase Rac1 permet la relocalisation de la protéine MTM1 aux niveaux de renflements membranaires dans les cellules de mammifères (Laporte et al., 2002). En réalisant un BLASTP sur génome de S. cerevisiae, j’ai pu identifier quatre protéines similaires à la GTPase humaine RAC1 : Cdc42, Rho1, Ypt6 et Rho2. Parmi elles, trois sont essentielles à la survie de la levure et seul le mutant ypt6Δ est viable. Chez S. cerevisiae, Ypt6 est une Rab GTPase impliquée dans la voie de sécrétion et requise pour la fusion des vésicules dérivées des endosomes avec l’appareil de Golgi. Elle joue également un rôle dans la maturation de la carboxypeptidase Y (CPY), une protéase vacuolaire (Luo and Gallwitz, 2003). Les résultats du BLASTP sont représentés dans le tableau ci-dessous.

Tableau 3 : Identification par BLASTP de protéines de levures similaires à Rac1 humaine. BLAST réalisé en confrontant la séquence peptidique de la GTPase humaine Rac1

aux protéines de levures.

Pour mieux comprendre la distribution membranaire de MTM1 dans S. cerevisiae, j’ai analysé l’implication de la GTPase de levure Ypt6. En effet, cette protéine pourrait être, au moins en partie, suffisamment similaire à la GTPase humaine Rac1 pour relocaliser MTM1 à la membrane. J’ai donc surexprimé les myotubularines MTM1^WT et MTM1^R69C à l’aide du plasmide pVV214 (multicopie et promoteur fort PGK) et observé leurs distributions dans un mutant ypt6Δ.

Protéine identifiée par BLASTP E-value Viabilité du mutant de délétion

CDC42 6.8e-39 Délétion létale RHO1 2.2e-25 Délétion létale

YPT6 7e-20 Viable

RHO2 7.5e-14 Délétion létale

Figure 56 : Distribution en fractionnement subcellulaire de MTM1WT et MTM1R69C dans une levure ypt6Δ. Fractionnement subcellulaire à partir d’extrait de levures BY4742 délétées pour le gène codant pour la GTPase Ypt6 et surexprimant la myotubularine sauvage ou le mutant du domaine PH-GRAM, MTM1R69C. L’absence de Ypt6 n’est pas d’influence sur la distribution membranaire de MTM1WT et MTM1R69C.

Partie II : Résultats et Discussion - MTM1 est recrutée aux membranes dans S. cerevisiae

Les résultats montrent que les levures ypt6Δ ne présentent pas de défaut dans la distribution des marqueurs Vps10 et Pgk1 et leurs distributions sont identiques à une levure sauvage BY4742 (Figure 55 et Figure 56). En ce qui concerne la distribution des myotubularines MTM1^WT et MTM1^R69C, dans les deux cas, les protéines sont majoritairement détéctées dans les fractions P13 et P100 (Figure 56). L’absence de Ypt6 n’a donc aucune influence sur la localisation aux membranes ni de de MTM1WT ni du mutant du domaine PH-GRAM MTM1R69C.