Activité enzymatique de MTM1s recombinantes

1. Production et purification de GST-MTM1

Afin d’analyser les activités enzymatiques in vitro des différents mutants MTM1, avant de purifier les MTM1 à partir de la levure (voir figure S4 de l’article), nous avions dans un premier temps utilisé la production en bactérie de protéines recombinantes, de la même manière que pour les expériences avec les membranes PIP Array^TM. Après purification par chromatographie d’affinité sur des billes de glutathione-sepharose, les éluats ont été analysés par SDS-PAGE suivie d’une coloration au bleu de Coomassie du gel. La coloration révèle une bande à 97 kDa correspondant au poids moléculaires des GST-MTM1s et plusieurs bandes protéiques de poids moléculaires inférieurs 97 kDa (Figure 47). Ces mêmes bandes apparaissent pour tous les échantillons GST-MTM1 sauvage (WT) ou mutantes (C375S, V49F et R69C) avec une grande reproductibilité.

Figure 47 : Coloration au bleu de Coomassie des extraits protéiques purifiés par GST-pulldown. 10 µg de

chaque échantillon sont séparés par SDS-PAGE 10%. La bande correspondant à GST-MTM1 est attendue aux

De plus, l’étiquette GST pourrait également influencer sur les liaisons avec les substrats, notamment pour des raisons d’encombrement stérique avec le domaine PH-GRAM. Ces deux derniers points seront discutés plus en détail dans la suite de mon travail.

Les différences entre nos résultats et ceux de Tsujita et al. peuvent donc laisser penser que le protocole expérimental tel que les bactéries utilisées, les conditions de culture et d’induction de la production de la protéine, les tampons utilisés, les temps d’incubations ou la température pourrait amener à des résultats différents. Mais surtout, la technique du test d’interaction protéine –PPIn par PIP-array a été beaucoup critiquée en particulier par Mark A. Lemmon en raison de son manque de reproductibilité pour des protéines ne liant pas les PPIn avec une très forte affinité, ce qui est sans aucun doute le cas pour MTM1 et son domaine PH-GRAM.

une extraction des bandes correspondantes du gel (Figure 48). Les analyses montrent que la bande à 97 kDa correspond bien à la protéine de fusion GST-MTM1. Les deux autres protéines ont été identifiées comme étant des chaperons (molecular chaperone DnaK et chaperonin GroEL, Figure 49) endogènes à E. coli qui sont induits en présence de protéines mal répliées. Par ailleurs, nombre de protéines chaperonnes sont des protéines de choc thermique c'est-à-dire qu’elles sont exprimées en réponse à des variations de température, ou d'autres types de stress cellulaires. On peut alors supposer que l’induction de la synthèse de GST-MTM1 a généré un stress cellulaire induisant l’expression de ces protéines chaperons en grande quantité. Les concentrations des éluats mesurées par Bradford sont donc à pondérer avec le ratio MTM1/chaperons/GST libre, qui est malheureusement difficile à estimer. Les quantités de protéines utilisées dans le test de déphosphorylation in vitro indiquées sur la Figure 51 correspondent à la quantité totale de protéines de l’éluat. Figure 48 : Isolement des bandes

principales après purification de GST-MTM1. Les protéines contaminantes

ont été isolées par découpage du gel, référencées et remises à la plateforme protéomique de l’IBMC (Strasbourg).

Figure 49 : Analyse par spectrométrie de masse des bandes isolées après séparation sur gel. La bande à 97 kDa

correspond effectivement à la protéine de fusion GST-MTM1. Les résultats ont permis d’identifier les protéines contaminantes comme étant des protéines chaperonnes de la bactérie E. coli ayant servi à la production de la protéine humaine MTM1.

Partie II : Résultats et Discussion - Activité enzymatique de MTM1s recombinantes

2. Test d’activité enzymatique in vitro

La myotubularine MTM1 sauvage se lie à son substrat le PtdIns3P ou le PtdIns(3,5)P2 qu’elle déphosphoryle en PtdIns et en PtdIns5P respectivement, alors que le mutant dans le site catalytique MTM1C375S est inactif (Blondeau et al., 2000; Schaletzky et al., 2003; Taylor et al., 2000). Afin de déterminer l’activité phosphatase des mutants MTM1V49F et MTM1R69C, j’ai réalisé une réaction enzymatique in vitro en utilisant les protéines purifiées GST-MTM1WT, GST-MTM1C375S, GST-MTM1V49F et GST-MTM1R69C en présence des phosphoinositides fluorescents BODIPY®-FL-PtdIns3P ou BODIPY®-FL-PtdIns(3,5)P2 (Figure 50). Ces molécules sont couramment utlisées dans des tests de phosphorylations ou de déphosphosphorylation par des phosphatases ou des kinases à PPIn.

Après 30 min d’incubation à 37°C les produits des réactions sont traités puis séparés par chromatographie sur couche mince en plaque de silice. La progression du solvant séparera les différents phosphoinositides selon leur degré de solubilité dans le solvant utilisé allant du moins soluble (ici, le PtdIns(3,5)P2), qui migrera lentement et restera donc proche de la ligne de dépôt au plus soluble (ici le PtdIns) qui migrera plus loin dans la plaque de silice. Les PPIn mono-phosphorylés, le PtdIns3P et le PtdIns5P migreront à mi-distance sur la plaque. Les substrats fluorescents sont visualisés par exposition à un rayonnement ultra-violet.

Après l’essai in vitro, la chromatographie révèle que la protéine GST-MTM1WT déphosphoryle le PtdIns3P en PtdIns, et le PtdIns(3,5)P2 en PtdIns5P comme cela été démontré

Figure 50 : Structure des BODIPY FL-PtdIns. Ces PPIn sont liés à un groupe fluorescent, le BODIPY

analyses sont effectuées en parallèle avec la protéine GST-MTM1^C375S inactive. Comme cela avait été publié précédemment, aucune conversion des substrats n’a pu être observée pour le mutant MTM1^C375S (Figure 51A). Par contre, avec les concentrations protéiques utilisées dans cet essai (5μg), à 37°C, la réaction de déphosphorylation du PtdIns(3,5)P2 pat MTM1WT n’est pas totale, en effet il reste encore du substrat lipidique non déphosphorylé après la réaction (Figure 51A).

Les résultats montrent que le profil de chromatographie observé après le test de déphosphorylation in vitro réalisé avec la protéine GST-MTM1V49F est similaire à celui obtenu avec le mutant catalytique inactif MTM1C375S (Figure 51B). Ce résultat suggère que MTM1V49F présentant une mutation dans le domaine de liaison aux phosphoinositides (domaine PH-GRAM, Figure 31) n’est pas active in vitro, du moins à la concentration utilisée. Cependant, la forme MTM1R69C, mutée dans ce même domaine PH-GRAM, affiche une activité réduite par rapport à la protéine sauvage. De plus, cette activité augmente en doublant la quantité protéique de GST-MTM1^R69C utilisée dans le test de déphosphorylation in vitro, contrairement à la forme MTM1^V49F qui n’affiche aucune activité aux deux concentrations de protéines testées (1 µg et 2 µg de protéines pour 0,6 µg de substrat) (Figure 51B).

DISCUSSION

Ces résultats sur l’activité enzymatique des différentes formes de MTM1 recombinantes produites dans E. coli sont les premiers que j’ai obtenu concernant la capacité des différents mutants à déphosphoryler le PtdIns3P et le PtdIns(3,5)P2. L’expérience montre que les mutations V49F et R69C dans le domaine PH-GRAM affectent l’activité phosphatase de MTM1 in vitro. De plus, ces résultats montrent que le mutant MTM1^V49F ne présente pas d’activité phosphatase aux concentrations utilisées. Quant au mutant MTM1^R69C, sa capacité à déphosphoryler le PtdIns3P et le PtdIns(3,5)P2 in vitro est clairement réduite par rapport à la protéine sauvage. Ces résultats nous ont surpris étant donné que leur expression chez la levure induisait un phénotype « large vacuole » suggérant qu’elles étaient actives in vivo.

D’autre part les mutations sont localisées dans le domaine PH-GRAM de l’enzyme et le domaine catalytique phosphatase de ces deux mutants (MTM1^V49F et MTM1^R69C) est intact. En effet, les données concernant le domaine PH-GRAM de MTM1 suggèrent que ce domaine est important pour la localisation de la protéine et qu’il permet le recrutement de MTM1 aux membranes contenant ses substrats, soit par la reconnaissance directe du PtdIns3P et/ou du PtdIns(3,5)P2, soit par le biais d’interactions protéine/protéine. Par conséquent, in vivo, si MTM1

Partie II : Résultats et Discussion - Activité enzymatique de MTM1s recombinantes

Figure 51 : Activité enzymatique in vitro à partir des différentes formes de GST-MTM1 produites en bactéries.

Différentes formes de la phosphatase MTM1 (WT, V49F ou R69C) ont été incubées avec du PtdIns3P (en bleu) ou du PtdIns(3,5)P2 (en rouge) fluorescents. Les produits de la réaction sont séchés et séparés par chromatographie sur couche mince (TLC) sur une plaque de silice. La distance de migration permet de visualiser les différents phosphoinositides en présence et de déterminer s’il y a eu déphosphorylation ou non. Chaque dépôt contient 0,6 µg de phosphoinositide fluorescent. A) Activité enzymatique de MTM1WT et MTM1C375S. B) Activité enzymatique de MTM1WT, MTM1V49F et MTM1R69C. Les valeurs indiquées entre parenthèse en A) et en B) correspondent à la quantité de protéines de l’éluat utilisée pour la réaction.

A

B

n’est pas correctement localisée dans la cellule, son rôle dans la déphosphorylation des PPIn peut être compromis. Or dans mes expériences d’activité phosphatase, les protéines MTM1 ainsi que ses substrats sont libres en solution. Dans de telles conditions, une possible délocalisation des mutants MTM1V49F et MTM1R69C dans un contexte cellulaire ne devrait pas influencer la capacité de ces protéines à déphosphoryler leurs substrats en solution in vitro dans une tube. Ainsi, nous nous attendions à ce que les mutants MTM1V49F et MTM1R69C conservent une activité enzymatique au moins égale à la protéine sauvage, ce qui aurait expliqué les phénotypes vacuolaires des levures surexprimant les mutants MTM1^V49F et MTM1^R69C.

De plus, la purification de GST-MTM1 produite en bactérie montre que les éluats contiennent de nombreuses contaminations, notamment les protéines chaperonnes GroEL et DnaK. La chaperonine GroEL est même présente en quantité au moins 20 fois supérieure à GST-MTM1.