L’association de MTM1 aux membranes est très stable

Afin de déterminer le type d’interaction responsable de la localisation de MTM1 aux membranes, j’ai entrepris des expériences de solubilisation de MTM1. Pour cela j’ai utilisé divers agents chimiques ou des solutions ioniques que j’ai incubés en présence des extraits protéiques totaux. Puis j’ai séparé les fractions membranaires (P) des fractions solubles (S) par une centrifugation à 100,000xg pendant une heure à 4°C.

Le Na2CO3 (carbonate de sodium) agit en augmentant l’alcalinité du milieu (augmentation du pH), ce qui favorisera la dissolution de protéines sujettes aux interactions électrostatiques. En présence de NaCl (Chlorure de Sodium) on augmente la force ionique du tampon et les contre-ions ajoutés entoureront les multiples charges ioniques des protéines, ce qui aura pour effet d’augmenter sa solubilité. Le SDS (Dodecylsulfate de Sodium) est un détergent et tensioactif ionique fort, qui dénature les protéines en rompant les liaisons non-covalentes. Quant au Triton X100, il s’agit d’un

DISCUSSION

Ces résultats montrent que la GTPase de levure Ypt6, proche en séquence peptidique de la GTPase humaine Rac1, n’est pas impliquée dans la distribution membranaire des protéines MTM1WT et MTM1R69C. Néanmoins il n’est pas surprenant qu’une GTPase de levure ne soit pas responsable de la relocalisation d’une protéine humaine produite de manière hétérologue dans S.

cerevisiae, car ceci nécessiterait une importante conservation des processus cellulaires entre la

levure et l’Homme. En effet il est possible que ce processus d’adressage de MTM1 à la membrane plasmique ait une légitimité dans un organisme pluricellulaire complexe comme les mammifères mais qu’il n’ait pas de réel intérêt dans un modèle d’eucaryote unicellulaire tel que

S. cerevisiae. Ce mécanisme spécifique pourrait par conséquent ne pas être conservé chez la

pour isoler des protéines ancrées dans les membranes cellulaires.

Dans cette expérience, je n’ai pas récolté de fraction P13 (culot à 13,000xg) puisque je souhaitais observer une relocalisation de MTM1 des membranes vers le cytoplasme. En effet, suite à la lyse d’une culture de levure SEY6210 ymr1Δ transformées avec le plasmide pVV200_MTM1WT j’ai réalisé une courte centrifugation de 5 min à 500xg des extraits protéiques afin d’éliminer les cellules non lysées et les gros fragments de membranes plasmiques. Puis j’ai incubé ces extraits avec les différentes solutions pendant 30 minutes dans la glace. Enfin j’ai effectué une centrifugation à 100,000xg afin de séparer les membranes du cyosol. Ces deux fractions ont été déposées sur gel de polyacrylamide et analysées par Western Blot.

Dans les conditions contrôles, en absence de traitement, MTM1 est distribuée dans la fraction associée aux membranes P (Pellet) et est quasiment indétectable dans la fraction S (Supernatant) de la même manière que décrits dans les précédents résultats (Figure 57).

Un traitement avec 0.1 M de Na2CO3 ne modifie pas significativement la distribution de MTM1 puisqu’elle reste majoritairement présente dans la fraction P. Cette distribution est la même pour les extraits protéiques traités avec 0.5 M de NaCl, avec 1% de Triton X100 et 0.1% de SDS.

Par conséquent, aucun des agents chimiques ni aucunes des solutions salines n’a été capable de solubiliser MTM1^WT dans les conditions testées.

Figure 57 : Solubilisation de la myotubularine MTM1. Des extraits protéiques de levures ymr1Δ produisant

MTM1 sauvage ont été mis en présence soit de 0.1M de Na2CO3, de 0.5M de NaCl, de 1% Triton X100 ou de 0,1% de SDS afin de favoriser la dissolution de MTM1 et la relocaliser des membranes vers le cytoplasme. Cependant, aucun des traitements n’a permis de déplacer MTM1 des fractions membranaires (P) vers les fractions solubles (S)

DISCUSSION

J’ai pu montrer ici que l’interaction qui lie MTM1 aux membranes est très forte. En effet, aucun des traitements utilisés n’a permis de solubiliser MTM1. A ce jour, je n’ai pas pu expliquer les raisons de cette distribution dans les fractions membranaires. Des expériences complémentaires seront nécessaires pour élucider les raisons de cette localisation dans S.

Partie II : Résultats et Discussion - MTM1 est recrutée aux membranes dans S. cerevisiae

DISCUSSION GENERALE concernant la localisation membranaire de MTM1

Il est très surprenant de voir qu’en condition de surexpression, lors de laquelle une très grande quantité de MTM1 est produite, la quasi-totalité des protéines sont distribuées aux seins de compartiments associés aux membranes lors de fractionnements subcellulaires.

J’ai pu montrert ici que cette distribution dans les fractions membranaires P13 et P100 est indépendante :

- des PPIn, et plus particulièrement des substrats de MTM1, le PtdIns3P et le PtdIns(3,5)P2 puisqu’une augmentation de PtdIns(3,5)P2 lors d’un stress osmotique ne modifie pas le profil de distribution de MTM1. Par ailleurs, leur absence, dans un mutant

vps34Δ par exemple, n’y change rien. Le profil de distribution de MTM1 n’est pas modifié,

et ceci quel que soit les variations de PtdIns3P ou de PtdIns(3,5)P2 intracellulaires.

- des protéines Vps34, Fab1, Vac14 ou Fig4. En effet, dans les levures mutantes

vps34Δ, fab1Δ, vac14Δ et fig4Δ produisant MTM1WT, la myotubularine reste présente dans

les mêmes fractions lors de fractionnements subcellulaires. Pourtant dans les cellules humaines, MTM1 est recrutée aux endosomes par le complexe kinase VPS15/VPS34. De manière surprenante, mes résultats montrent que l’absence de Vps34 ne modifie sa distribution.

- de la GTPase de levure Ypt6. Cette dernière ne remplit donc pas les mêmes fonctions que la GTPase humaine Rac1 qui est impliquée dans la relocalisation de MTM1 au niveau de renflements membranaires dans les cellules humaines produisant une forme constitutivement active de Rac1 (Laporte et al., 2002).

La localisation membranaire des myotubularines MTM1 (sauvages ou mutantes) dans S. cerevisiae est identique quelle que soit la mutation faux-sens analysée. De ce fait, ces mutations

ponctuelles ne semblent pas influencer sur la capacité de MTM1 à être distribuée dans les fractions membranaires dans des expériences de fractionnement subcellulaires.

Je ne peux pas cependant pas exclure la possibilité que la surprodution de MTM1 dans la levure puisse être à l’origine de la formation d’aggrégats protéiques de hauts poids moléculaires fractionnant aves les membranes cellulaires. Par ailleurs cette distribution membranaire est

remarquablement résistante aux différents traitements de solubilisation testés (Na2CO3, NaCl, SDS et Triton X100). En outre, la détéction en Western Blot, en condition dénaturante, de MTM1 n’a pas permis de mettre en évidence d’oligomères de myotubularines. En effet, la myotubularine MTM1 n’a toujours été détéctée que sous sa forme monomérique.

Néanmoins si MTM1 est sous forme d’aggrégats de haut poids moléculaires résistants au SDS, il est possible que ces structures soient suffisamment imposantes pour ne pas pénétrer dans le gel et rester bloquées au niveau des puits de dépôt. Ceci est peu probable puisque l’analyse de la partie supérieure du gel de polyacrylamide correspondant au gel de concentration et comprenant les puits de dépôts, ne m’a pas permis de détecter de protéines MTM1.

Une autre possibilité pouvant expliquer que la quasi-totalité de MTM1 soit membranaire dans la levure vient de l’observation réalisée par Schaletzky et coll.. En effet, leurs travaux montrent que MTM1 est capable non seulement de s’homodimériser, mais également de former des oligomères en anneau composé de sept myotubularines en présence de PtdIns5P (Schaletzky et al., 2003) (Figure 58). Ainsi, de telles structures pourraient permettre le recrutement d’une grande proportion de myotubularines produite dans S. cerevisiae et limiter fortement la présence

de MTM1 dans le cytoplasme.

Bien que je n’ai pas pu mettre en évidence les raisons de cette localisation membranaire, nos résultats montrent sans ambigüité que les myotubularines MTM1^WT, MTM1^V49F, MTM1^R69C et MTM1^N180K sont actives in vivo dans la levure sous cette forme membranaire et que leurs activités phosphatases sont à l’origine des morphologies vacuolaires élargies observées. De plus, ces phénotypes vacuolaires sont d’autant plus visibles que la production d’une myotubularine active est importante. En effet, les élargisssements vacuolaires sont plus prononcés dans les cellules produisant une myotubularine active et transformées par le plasmide pVV200 (épisomique, haut nombre de copies, promoteur fort PGK) que dans le cas des cellules transformées avec un plasmide pVV204 (centromérique, 1-3 copies par cellule, promoteur bactérien TetO).

Par conséquent, si les myotubularines produites sont regroupées sous la forme d’aggrégats, il n’en reste pas moins qu’elles conservent une activité enzymatique, révélées par dosage des PPIn intracellulaires (Figures de l’article) et que cette activité est à l’origine d’une perturbation du trafic intracellulaire résultant en une morphologie vacuolaire aberrante.

Partie II : Résultats et Discussion - Effets de la surexpression de MTM1 dans S. cerevisiae sur diverses voies du trafic dépendants des PPIn

G. Effets de la surexpression de MTM1 dans S. cerevisiae sur diverses voies du