Dans le cadre du projet associé à la caractérisation du mutant S910L, nous avons effectué les transfections des cellules en co-exprimant les sous-unités du canal Nav1.5 avec leur sous-unité auxiliaire . En parallèle de cela, nous avons également voulu étudier l effet potentiel de la sous-unité en réitérant les expériences de patch clamp et de biotinylation de surface, mais sans celle-ci. Les résultats sont présentés dans les Figures 36 et 37 ainsi que dans la Tableau 9.
Le western-blot présenté dans la Figure 36A montre pour les fractions protéiques totales aucune différence d expression quelle que soit la condition de transfection considérée. Les cellules exprimant le mutant seul ((-)/S910L) présentent un taux d expression membranaire plus faible comparé aux cellules exprimant les canaux sauvages seuls (WT/(- . En considérant la condition mimant l hétérozygotie de la patiente (WT/S L , l expression membranaire des canaux Nav1.5 ne semble pas être différente par rapport à la condition WT/WT. Néanmoins, en réitérant cette expérience mais cette fois en séparant les protéines dans un gel de polyacrylamide moins concentré (5% contre % , il est possible de décrire de manière plus précise l impact de l expression et de la co-expression de S910L sur la forme WT (Figure 36B). En effet, par exemple lorsque le mutant est exprimé seul ((-)/S910L), la fraction correspondant aux protéines biotinylées ne présente qu une seule bande, là o‘ pour la condition WT/ -), deux bandes distinctes peuvent être observées. Ces bandes qui sont annotées par une flèche verte pour la bande supérieure et par une flèche violette pour la bande inférieure, correspondent aux états de glycosylation identifiés dans le chapitre 2. Il semble donc que le mutant, bien qu étant présent sous les formes matures et faiblement glycosylées dans la fraction totale, n est présent à la membrane que sous sa forme immature.
D autre part, en se focalisant sur la condition hétérozygote WT/S910L et en comparant avec la condition WT/WT, il est possible de distinguer un effet net sur l expression de la forme dite immature. En effet, lorsque que S L est co-exprimé avec les canaux WT, la bande correspondante présente une plus forte intensité, et ce au détriment de la bande supérieure qui semble moins intense.
Figure 36 : Le mutant S910L exerce un effet dominant négatif sur la localisation membranaire des canaux Nav1.5 sauvages.
Western Blot des fractions protéiques totales et membranaires des cellules HEK293T préalablement transfectées avec les canaux sauvages et/ou mutants en présence de la sous- unité 1. 10 µg de protéines totales et les protéines biotinylées récupérées à partir de 100 µg de lysat total sont séparées dans un gel 8% (A) ou dans un gel 5% de poly-acrylamide (B). Les flèches colorées indiquent la position des signaux correspondant au poids moléculaire apparent de Nav1.5.
Le mutant S9 L présente donc un profil d’expression et de maturation similaire au mutant R1432G avec une abolition du courant INa corrélée à une absence d’expression membranaire de la forme mature. Lorsque les deux formes sauvages et mutantes sont co-exprimées, le profil d’expression membranaire des canaux matures et immatures est altéré.
En ce qui concerne l étude fonctionnelle de l effet de la sous-unité , les enregistrements de patch-clamp ont permis d analyser les densités de courant ainsi que les paramètres d activation et d inactivation des canaux Figure 37 et Tableau 9).
En absence de la sous-unité , les densités de courant ne présentent aucune
différence significative que les canaux sauvages soient exprimés seuls (WT/(-), -384,4 ± 63,3 pA/pF, n=7) ou co-exprimés avec les mutants (WT/S910L, 261,6 ± 49,0
pA/pF, n =9, t-test) (Figure 37A et 37B). Ainsi, contrairement aux conditions de transfection en présence de , aucun effet dominant négatif exercé par le mutant S L n a pu être mis en évidence.
De même, nous avons montré un effet significatif de la co-expression de S910L sur les paramètres dactivation des canaux sauvages en présence de la sous-unité . Les expériences complémentaires menées en absence de cette sous-unité ne permettent pas de retrouver ni un déplacement de la courbe d activation à des potentiels plus dépolarisants, ni des variations significatives du potentiel de demi-activation ou de la constante de Boltzmann (Figure 37C et Tableau 9 . L inactivation des canaux sauvages semble, quand à elle, rester inchangée en présence du mutant S910L que ce soit avec ou sans sous-unité . )l faut noter qu un effet -indépendant de la co-expression du mutant S91 L est observé, avec un déplacement de la courbe d inactivation vers des potentiels plus dépolarisés (Tableau 9).
Comme dans le cas du mutant R G, le mutant S9 L n’exerce son effet dominant négatif sur la densité de courant INa sauvage uniquement en présence de la sous-unité . Son influence délétère sur l’activation des canaux WT dépend également d’un mécanisme -dépendant.
Figure 37 : L’effet dominant négatif exercé par le mutant S910L sur les canaux sauvages est aboli en absence de la sous-unité 1.
Analyse des courants INa enregistrés en configuration cellule entière sur des cellules HEK293T exprimant les canaux sauvages (WT/(-)) ou les canaux sauvages et mutants S910L (WT/S910L). (A) Représentation des pics de densité de courant moyenne à -40 mV. n.s., non significatif (t-test). (B) Courbes illustrant la relation entre la densité de courant et le potentiel imposé. Les résultats sont présentés pour les conditions de transfection avec ou sans la sous- unité 1. (C) Courbes illustrant la dépendance au potentiel des états stables d activation
symboles vides et d inactivation symboles pleins des canaux Nav1.5 sauvages et/ou mutants S910L. Le Tableau 9 résume les paramètres biophysiques déterminés après ajustement par une équation de Boltzmann.
Tableau 9 : Tableau récapitulatif des paramètres biophysiques des canaux sauvages (WT) et mutant S910L co-exprimés dans les cellules HEK293T avec ou sans la sous-unité 1.