Biotinylation de surface

Ce travail de thèse portant sur l étude de l adressage de mutants Brugada et de la forme sauvage de Nav1.5, la technique de biotinylation de surface se révèle incontournable pour ce qui est d analyser l expression membranaire des canaux et de la comparer à leur expression totale. Le principe de cette technique repose sur la fixation spécifique d un réactif de biotinylation clivable sur les protéines exposées à la surface membranaire. La biotine présente sur les protéines de surface permet dans un second temps de les isoler des protéines intracellulaires non marquées par un système de purification d affinité.

La majorité des expériences de biotinylation de surface ont été réalisées en collaboration avec le Dr. Romain Clément.

Pour l ensemble des expériences de biotinylation, les cellules préalablement transfectées et éventuellement traitées présentent un taux de confluence entre 90 et 95% dans des boîtes de 60 mm de diamètre. Les boîtes sont placées sur glace dès le début de la manipulation et toutes les solutions utilisées sont à 4°C. Cette précaution vise à ralentir les machineries de traduction, dégradation et recyclage membranaire des protéines.

Les cellules sont lavées rapidement deux fois avec du PBS froid avant d être placées dans du PBS froid supplémenté par du CaCl2 à 0,5 mM et du MgCl2 à 1 mM à pH 8 (PBSCM), qui permet de limiter les pertes d adhérence au support de culture. La solution de biotinylation est alors préparée extemporanément dans du PBSCM avec le réactif EZ- Link® Sulfo-NHS-SS-Biotin (Thermo Scientific) à 0,5 mg/mL. Les caractéristiques de ce réactif sont résumées dans la Figure 19.

Figure 19 : Représentation schématique de la structure du réactif de biotinylation EZ-Link® Sulfo-NHS-SS-Biotin (Thermo Scientific).

La molécule est composée d un groupe N-hydroxysuccinimidyl ester (NHS, en jaune) auquel est rattaché un groupe sulfonate en bleu , l ensemble étant relié à la biotine en rouge) par un bras espaceur contenant un pont disulfure (en vert). La partie NHS permet au réactif de se lier covalemment à la chaîne latérale des résidus Lysines exposés à la surface membranaire des cellules à pH alcalin. Le groupe sulfonate, de par sa charge négative, améliore la solubilité du réactif en solution aqueuse et assure son imperméabilité membranaire, « l étiquetage » s effectuant uniquement sur les protéines de surface sans accès intracellulaire. Le pont disulfure est réductible en présence de

-mercaptoéthanol ou tout autre agent réducteur. La biotine présente une forte affinité pour la streptavidine, caractéristique essentielle pour l étape de purification à l aide des billes High Capacity Streptavidin Agarose Resin (Thermo Scientific).

Les cellules sont mises en présence de cette solution de biotinylation (140 µL/cm²) pendant 25 min à 4°C sans agitation et sur une surface plane. La réaction

de biotinylation est alors arrêtée par trois lavages successifs de 5 min avec une solution de quenching contenant du PBSCM à 0,5% (m/v) de BSA (Albumine Sérique Bovine) et 50 mM de glycine. Les cellules sont ensuite lavées trois fois 5 min dans du PBS avant d être lysées selon le protocole décrit précédemment dans la partie « Extraction Protéique » des lignées HEK293T.

Un dosage protéique est immédiatement réalisé sur les lysats clarifiés avant de procéder à l étape de purification des protéines biotinylées. Dans un premier temps, les billes High Capacity Streptavidin Agarose Resin (Thermo Scientific) sont équilibrées dans du tampon de lyse. Dans un second temps et en duplicat, µL de billes d agarose sont mis en contact avec 100 µg de lysats protéiques dans un volume final de 500 µL

ajusté avec du tampon de lyse dans un tube de 1,5 mL. Les tubes sont alors placés à 4°C sur la nuit sous agitation rotative. Les lysats clarifiés contenant les protéines totales sont placés à -20°C en attente de leur dénaturation ou d une deuxième tentative de purification des protéines biotinylées.

Le lendemain, les échantillons sont centrifugés 30 s à 20000 g afin de récupérer les billes puis d effectuer par la suite trois lavages dans µL de tampon NET Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, NP40 0,05% (v/v), pH 7.4). Cette étape permet d éliminer les protéines non biotinylées fixées non-spécifiquement aux billes. Enfin, la dernière étape consiste en l élution des protéines en incubant les billes avec µL de tampon Laemmli 2x à 37°C pendant 1 h.

En effet, une des caractéristiques du réactif EZ-Link® Sulfo-NHS-SS-Biotin est la présence d un pont disulfure faisant le lien entre la molécule de biotine et le groupe N-hydroxy succinimidyl ester (NHS) (Figure 19). Par conséquent, la simple action de l agent réducteur contenu dans le tampon de dénaturation permet de détacher les protéines biotinylées des billes en réduisant les ponts disulfures. Cette réaction permet de laisser ainsi en place la biotine fixée aux billes de streptavidine, les protéines éluées se retrouvant alors dans le tampon de dénaturation. )l faut noter que l élution est réalisée à 37°C, température qui est identique à celle utilisée pour la dénaturation des échantillons.

Les échantillons correspondant aux fractions membranaires et donc aux protéines biotinylées éluées, ainsi que les lysats protéiques correspondant à la fraction totale sont analysés par la suite avec la technique du western-blot.

D) Co-immunoprécipitation

Dans le cadre de ce projet, la méthode de co-immunoprécipitation (co-IP) présente un double intérêt i dans un premier temps d identifier les interactions potentiellement mises en place entre deux ou plusieurs sous-unités du canal Nav1.5 (ii) dans un deuxième temps, de tenter de moduler ces interactions. La mise en place de cette technique est réalisée en collaboration avec le Dr. Thomas Harnois.

Les co-immunoprécipitations sont réalisées à partir de lysats de cellules ayant été transfectées avec deux formes distinctes de Nav1.5 :

- L une étiquetée avec l épitope FLAG et codée par la construction pcDNA-Flag- Nav . . L étiquette Flag est un peptide hydrophile de acides aminés DYKDDDDK, celui-ci ayant été inséré après le 301ème _{acide aminé au niveau de la boucle S5-S6} extracellulaire du domaine I de Nav1.5. Des versions de cette forme étiquetée sauvage et mutée R1432G sont utilisées pour ces expériences.

- L autre est une protéine de fusion comprenant à l extrémité N-terminale de Nav1.5 sauvage, une séquence protéique de 239 acides aminés correspondant à une protéine fluorescente verte (GFP : Green Fluorescent Protein).

Le protocole d extraction protéique ne diffère de celui décrit précédemment que par le tampon de lyse utilisé. En effet, le tampon de lyse RIPA (Radio- ImmunoPrecipitation Assay) est constitué de Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, NP40 0,05% (v/v), DOC 1% (m/v), SDS 10% (m/v), Triton X-100 1% (v/v).

A partir des échantillons issus des extractions protéiques, pour chaque condition, µg de lysat clarifié sont ajoutés à µL de tampon NET et à µg d anticorps monoclonal Anti-Flag M2 (F1804, Sigma-Aldrich). Ce mélange est incubé sur la nuit à 4°C sous agitation rotative. Le lendemain, les échantillons sont mis en présence de 30 µL de billes G-sépharose (GE Healthcare) à 100 mg/mL pendant 1 h à 4°C toujours sous agitation rotative. Les protéines G, qui sont des protéines membranaires de streptocoque, sont couplées covalemment aux billes de sépharose et présentent la capacité de se lier aux fragments constants Fc des immunoglobulines G de mammifère. Afin de récupérer spécifiquement les protéines étiquetées, les anticorps et accessoirement les protéines partenaires de Nav1.5, les complexes protéiques liés aux billes sont lavés trois fois dans du tampon NET avant d être élués dans du tampon dénaturant Laemmli 2X à 37°C pendant 1 h. Les échantillons sont alors analysés en western-blot.