L étape préliminaire de cette partie du projet a consisté à comparer les profils d expression des canaux Nav . issus des modèles d expression utilisés et de tissus cardiaques natifs comprenant majoritairement des cardiomyocytes. Pour ce faire, nous avons séparé sur un gel faiblement concentré en polyacrylamide (5%) les protéines extraites de HEK293T surexprimant les canaux sauvages ainsi que celles issues de biopsies auriculaires humaines (Figure 31).
Les signaux obtenus en western-blot en utilisant l anticorps Anti-pan-Nav montrent l existence de quatre bandes A, B, C et D retrouvées pour la fraction protéique provenant des HEK293T. Les bandes A et B correspondent aux poids moléculaires de ~250 et ~265 KDa préalablement décrits lors des expériences de biotinylation. Néanmoins, il est possible d observer à des poids moléculaires plus faibles, deux autres bandes C et D de plus faibles intensités, respectivement à ~200 et ~175 KDa.
Figure 31 : Les canaux Nav1.5 présentent différents états de maturation et/ou de dégradation.
L expression protéique des canaux Nav1.5 est analysée par western blot à partir de lysats de cellules HEK293T exprimant les canaux sauvages (à gauche, 15 µg) ou de lysats de biopsie auriculaire humaine (à droite, 100 µg). La migration est réalisée sur gel SDS-PAGE à % de polyacrylamide. Les signaux révélés en utilisant l anticorps Anti- pan-Nav sont fléchés.
Concernant les extraits protéiques issus de biopsies, seules trois des bandes sont identifiées aux mêmes poids moléculaires que dans les HEK293T : les bandes A, B et C. Il faut noter que le profil d expression de ces canaux bien que similaire de par la présence des mêmes bandes, diffère au niveau de l intensité de signal. C est le cas pour la bande A, qui est majoritaire dans les cellules cardiaques par rapport à la bande B, ce profil étant inversé dans les HEK293T.
Le canal Nav1.5 est présent sous différentes formes de maturation et de dégradation, que ce soit dans un modèle d’expression type (EK 9 T ou les cellules natives cardiaques. La bande A semble être la forme majoritairement exprimée dans ces dernières, et est retrouvée, bien que dans une moindre proportion, dans notre modèle d’étude, ce qui nous permet de le valider avant de commencer l’identification des différentes formes de Nav1.5.
II – Mise en évidence des états de N-glycosylations de Na
v1.5
Tous les canaux sodiques dépendants du potentiel sont connus pour subir des modifications post-traductionnelles, et notamment par N-glycosylation (Cohen & Levitt, 1993 ; Bennett, 2002 ; Zhou et al., 2002).
Afin d identifier la nature des N-sucres potentiellement attachés aux canaux Nav1.5, nous avons utilisé la stratégie de déglycosylation. Dans un premier temps, nous nous sommes assurés que les bandes A et B correspondaient bien à des états de N-glycosylation en traitant des cellules HEK293T transfectées transitoirement avec la tunicamycine (Figure 32A). Le traitement qui a été effectué avec des doses croissantes allant de 0,2 à 1 µg/mL pendant 18 h, sest révélé efficace avec la dose la plus faible testée. A 0,2 µg/mL, la tunicamycine fait disparaître la bande B et diminue en intensité le signal de la bande A. Une nouvelle bande, fléchée en rouge, apparaît et correspond à un poids moléculaire plus faible. Les traitements de 0,5 et 1 µg/mL ne permettent de visualiser aucune des bandes A et B mais uniquement la bande « rouge » correspondant vraisemblablement à un état dé-N-glycosylé.
Figure 32 : Les canaux Nav1.5 présentent différents états de N-glycosylation.
Western blots représentatifs n= de l expression protéique des canaux Nav1.5 après ou sans déglycosylation. (A) Les cellules HEK293T exprimant transitoirement les canaux sauvages, sont incubées en présence de 0,2, 0,5 ou 1 µg/mL de tunicamycine pendant 18 h. Les lysats WT/(-) sont traités (+) ou non (-) avec la PNGase F ou l endoglycosidase ( Endo ( . Ces traitements sont également réalisés sur des lysats provenant de cellules exprimant stablement Nav1.5 sauvages (B) ou de biopsies auriculaires humaines. (C) La migration est réalisée sur gel SDS-PAGE à 5% de polyacrylamide. Les signaux révélés en utilisant l anticorps Anti-pan-Nav sont fléchés en vert (bande A supérieure), en violet (bande B inférieure) et en rouge (bande
Par la suite, nous avons utilisé deux enzymes de déglycosylation sur des extraits protéiques issus de HEK293T exprimant Nav1.5 WT transitoirement (Figure 32A), de la lignée stable Nav1.5 (Figure 32B), et enfin des biopsies auriculaires humaines (Figure 32C . L objectif de cette expérience est de déterminer quel s type(s) de N-sucre sont attachés aux canaux et dans quel(s) compartiment(s) intracellulaire(s) ce processus de maturation se met en place. Que ce soit dans la lignée stable ou les cellules exprimant transitoirement les canaux Nav . , l incubation enzymatique des lysats en présence de la PNGase F permet d obtenir le même profil de migration qu avec un traitement des cellules en présence de tunicamycine. Dans le cas d une digestion enzymatique en présence d endoglycosidase (, le profil de migration obtenu est différent. La bande B est sensible au traitement et est retrouvée au niveau de la bande déglycosylée (rouge). Quant à la bande A, le traitement en présence d endo ( ne modifie pas sa mobilité électrophorétique, elle semble donc être résistante à la digestion.
Concernant les expériences menées sur les lysats de biopsies, nous n avons pu observer que l effet de la digestion sur la bande A qui est majoritairement exprimée dans le tissu cardiaque. Cette bande présente, comme dans les lignées HEK293T, une résistance à l endo ( et une sensibilité à la PNGase.
Le canal Nav1.5 est exprimé sous deux formes glycosylées qui sont retrouvées en western-blot sous la forme i d’une bande B dont les N-glycanes sont sensibles à l’endo (, suggérant que cet état de glycosylation est atteint au niveau réticulaire ii d’une bande A dont les N-sucres sont résistants à l’endo (, impliquant nécessairement une modification additionnelle des glycanes au niveau golgien. Cette dernière bande correspondant à un état de maturation plus avancé, peut être considérée comme la forme mature du canal Nav1.5.
Dans l idée de caractériser plus précisément l adressage des canaux sodiques, nous avons utilisé la bréfeldine A connue pour altérer la voie classique de sécrétion protéique entre le RE et l appareil de Golgi Figure 33).
Nous avons traité des cellules HEK293T qui ont été transfectées transitoirement avec le canal Nav1.5 WT. Dans un premier temps, des traitements de 24 h à 50 ou 500 ng/mL de bréfeldine A ont été testés (Figure 33A).
Figure 33 : Les canaux Nav1.5 sont adressés à la membrane via les voies de sécrétion classique et non conventionnelle.
Les cellules HEK293T transfectées avec les canaux sauvages WT ou mutant L325R sont traitées 24 ou h en présence de à ng/mL de bréfeldine A. L incubation est réalisée dès le début de la transfection (traitement à T0h) ou 24 h post-transfection (traitement à T24h). (A, B) Les western blots montrent les signaux correspondant aux états glycosylés de Nav1.5 après différents traitements. (B) Analyse des densités de courant INa de cellules exprimant les canaux WT et traitées 48 h avec 50 ng/mL de bréfeldine A. (C) Western Blot représentatif (n=2) des fractions protéiques totales et membranaires des cellules HEK293T exprimant les canaux WT. La migration est réalisée sur gel SDS-PAGE à 5% de polyacrylamide. Les signaux révélés en utilisant lanticorps Anti-pan-Nav sont fléchés en vert (bande A supérieure) et en violet (bande B inférieure).
Que les cellules soient traitées dès le début de la transfection ou 24 h plus tard, la bande A semble insensible aux deux doses de bréfeldine A.
Nous avons donc augmenté la durée de traitement à 48 h avec une dose de 50 ng/mL (Figure 33B). La bande A est restée inchangée en intensité en présence de bréfeldine A. Or, des expériences de patch-clamp ont été réalisées en parallèle et ont montré une réduction significative de la densité de courant INa sauvage de 79% entre la condition contrôle (533,8 ± 84,5 ; n = 3) et la condition traitée (114,3 ± 34,5 ; n = 3 ; P<0,05 ; t-test). De plus, en réitérant le traitement mais cette fois sur des cellules exprimant le mutant L325R, une bande A peut être observée en condition traitée et pas dans la condition contrôle.
Enfin, nous avons suivi l effet du traitement en présence de bréfeldine A sur l adressage membranaire des canaux Nav1.5 par la technique de biotinylation de surface (Figure 33C . Comme attendu, l expression totale des canaux n est pas altérée par le traitement à la bréfeldine, cependant, la fraction membranaire a son profil de migration modifié. En effet, la bande B est retrouvée plus intense alors qu au contraire, la bande A semble être moins présente dans la condition traitée.
La bréfeldine n’influence pas l’expression totale des canaux Nav1.5, mais altère leur adressage membranaire. La forme B présente dans la fraction membranaire pourrait transiter via la voie non conventionnelle d’adressage qui est indépendante de l’appareil de Golgi. La forme A, quant à elle, présente deux particularités : (i) sa maturation est insensible au traitement à la bréfeldine, laissant penser que le dernier état de glycosylation est atteint entre le réticulum endoplasmique et le golgi médian (ii) son adressage membranaire est sensible au traitement à la bréfeldine, impliquant que la forme mature transite par la voie traditionnelle d’adressage.
III – Etude des voies protéolytiques impliquées dans la dégradation de
Na
v1.5
En parallèle de l étude de la voie de sécrétion des canaux sodiques, nous nous sommes intéressés au devenir des canaux sauvages et mutants retenus dans les
compartiments cellulaires, et plus particulièrement aux voies protéolytiques impliquées dans leur dégradation.
Le canal Nav1.5 est une protéine dont la dégradation est régulée par ubiquitinylation, notamment via l action de la ligase L Nedd -2 (van Bemmelen et al., 2004). Une fois polyubiquitinylées, ces protéines « substrats » peuvent être reconnues par le protéasome, où elles sont dégradées. Cependant, le système UPS (pour Ubiquitin
Proteasome System) n est pas la seule grande voie protéolytique cellulaire, et est associé
au système autophagique/lysosomal. Or, concernant les canaux sodiques dépendants du potentiel, aucune étude n a clairement mis en évidence l implication de cette voie lysosomale, et ce bien qu elle soit souvent proposée comme mécanisme de dégradation. Dans le cadre de notre projet, nous avons voulu caractériser ces voies de dégradation dans notre modèle de surexpression que sont les cellules HEK293T.
Préalablement, nous avons montré dans le chapitre précédent par l utilisation de l inhibiteur du protéasome S, le MG , que ni l expression du mutant d adressage R1432G, ni celle des canaux sauvages en présence la sous-unité , ne modifiaient le taux de leur dégradation protéasomale (Figure 29).
Par conséquent, lorsque des canaux n atteignent pas la membrane et ne semblent pas subir de dégradation excessive liée au protéasome, qu advient-il de la population de canaux mutants, ou des canaux sauvages sur lesquels s exerce l effet dominant négatif ?
Nous avons continué notre étude en utilisant deux agents pharmacologiques que sont la leupeptine et la bafilomycine A et qui ciblent la voie lysosomale à deux niveaux différents. La bafilomycine prévient la maturation des endosomes et bloque précocement la voie autophagique/lysosomale, alors que la leupeptine inhibe spécifiquement les protéases à sérine et cystéine dans le compartiment lysosomal (Figure 34).
Figure 34 : Les canaux Nav1.5 sont dégradés via la voie lysosomale.
Western blots représentatifs n= de l expression protéique des canaux Nav1.5 dans des cellules HEK293T traitées ou non avec des inhibiteurs de la dégradation lysosomale. Les cellules HEK293T sont transfectées avec un vecteur vide (Mock), des canaux sauvages (WT/WT), des canaux mutants (R1432G/R1432G), des canaux sauvages et mutants (WT/R1432G), les canaux sauvages ou mutants et le vecteur vide (WT/(-) ; R1432G/(-) et cela en présence de 1. (A) Les cellules sont traitées 6 h en présence de 100 µM de leupeptine, (B) ou en présence de 50 nM de bafilomycine A et/ou de 10 µM de MG132 pendant 6 h. Les migrations sont réalisées sur gel SDS-PAGE à % de polyacrylamide. Les signaux révélés en utilisant l anticorps Anti-pan-Nav sont fléchés : la grande flèche est au niveau des bandes A et B et les deux petites flèches montrent les bandes correspondant à des poids moléculaires plus faibles C et D.
Le traitement en présence de leupeptine a été réalisé sur des cellules exprimant les formes WT et R1432G seules, ou co-exprimant les deux types de canaux Nav1.5 (Figure 34A). Les western-blots ne permettent pas de détecter une variation d expression au niveau des bandes A et B, que les cellules aient été traitées ou non. Néanmoins, il est possible d observer systématiquement dans les conditions traitées une atténuation en intensité de la bande C, et ce quelle que soit la condition de transfection.
L étude de l effet de la bafilomycine A n a été suivie que sur trois conditions de transfection permettant de co-exprimer les formes sauvages et/ou mutantes R1432G (Figure 34B). La littérature suggère que les systèmes du protéasome et autophagie/lysosome « dialoguent » entre eux. En effet, lorsque la voie protéasomale est submergée et nécessite une réponse adaptative de la voie autophagique dite alternative, cette dernière prend alors en charge les protéines polyubiquitinylées en attente de dégradation. Ainsi, pour étudier cette possibilité, nous avons effectué un double traitement MG132/bafilomycine.
Au regard des western-blots obtenus, nous avons pu montrer l efficacité du traitement à la bafilomycine, en suivant la conversion du LC3-I en LC3-II (LC3 pour
microtubule-associated protein 1 light chain 3). En effet, bloquer l autophagie revient à
accumuler cette protéine sous sa forme active (LC3-II), ce qui est le cas pour toutes les conditions traitées. Concernant Nav . , l application de bafilomycine permet d augmenter la quantité de canaux sauvages, mais diminue celle des mutants ou des canaux sauvages co-exprimés avec les mutants. D autre part, il est intéressant de noter que la bande D disparaît systématiquement dans les conditions traitées. Enfin, en co- traitant les cellules en présence de MG et de bafilomycine, nous n avons pas observé de modification de quantité de canaux quelle que soit la condition de transfection considérée.
La bande C correspond à un produit de dégradation lié à l’activité des protéases à sérine et cystéine lysosomales alors que la bande D correspondrait quant à elle à une forme dégradée issue de l’ensemble des processus de dégradation lysosomale. Les canaux Nav1.5 sauvages sont donc à la fois dégradés
Concernant les canaux mutants qu’ils soient co-exprimés ou non avec les canaux WT, l’implication de la voie lysosomale semble limitée par rapport à la voie UPS, suggérant une complémentarité des deux systèmes protéolytiques dans la dégradation des canaux sodiques.
IV – Etude préliminaire : Implication de la réponse UPR et de la voie
autophagique
Au vu des résultats précédents, nos travaux laissent suggérer que les canaux mutants et les canaux WT lorsqu ils sont co-exprimés, seraient retenus dans le réticulum endoplasmique, et ce sans subir de dégradation excessive liée à la voie ERAD et donc à la voie protéasomale. Nous nous sommes donc naturellement demandés si l expression des canaux Nav . qu ils soient mutants ou sauvages, pouvait engendrer un stress au niveau réticulaire via l activation de la réponse †PR. D autre part, nous avons également voulu tester en parallèle l effet non plus de l inhibition mais de l activation de l autophagie. Pour ce faire, nous avons placé les cellules transfectées en condition de déprivation en acides aminés et facteurs sériques, soit 20 h dans une solution saline HBSS (Figure 35). Ce type de milieu dit « déprivé » est connu pour stimuler les processus autophagiques (Mortimore & Schworer, 1977 ; Pattingre et al., 2003).
Le suivi de l expression de la protéine adaptatrice p permet d apprécier l activation de l autophagie. Cette protéine est capable de se fixer aux protéines polyubiquitinylées et de les emmener à un autophagosome naissant. Ainsi la stimulation de l autophagie stimule la dégradation des substrats ubiquitinylées ainsi que celle de p62 qui leur est associée. Comme attendu, en cas de déprivation en acides aminés, il est observé une diminution de la quantité de p62 et ce quelle que soit la condition de transfection.
En parallèle, pour étudier la réponse UPR, nous nous sommes intéressés au facteur d initiation de la traduction e)F , qui après activation de la voie PERK, se retrouve phosphorylé. Cet état de phosphorylation ainsi que la quantité totale de facteurs ont donc été suivis. Il est important de mentionner ici que la réponse UPR ne semble pas plus activée, que les cellules co-expriment ou non avec les canaux WT, les mutants d adressage R G en présence de la sous-unité . Cependant, et de façon surprenante, la même expérience mais cette fois dans des conditions de transfection
Figure 35 : Effet de la déprivation en acides aminés sur l’expression des canaux Nav1.5.
Western blot n= de l expression protéique des canaux Nav1.5 et de protéines liées à la réponse UPR (Unfolding Protein Response, eIF2 phosphorylé et total ou à l autophagie (p62). Les cellules HEK293T transfectées sont placées dans un milieu déprivé en acides aminés pendant 20 h. Les cellules co-expriment les canaux Nav1.5 sauvages et/ou mutants R1432G en présence ou en absence de la sous-unité 1.
sans sous-unité , indique que la réponse †PR est activée via la voie PERK dans les deux conditions de transfection. De plus, en stimulant l autophagie, en condition de déprivation, nous avons normalisé la réponse UPR au même niveau qu en présence de
.
Enfin, si en condition de culture classique, le niveau d expression des canaux Nav . est identique dans toutes les conditions de transfection, ce n est pas le cas après déprivation en acides aminés. En effet, nous pouvons constater que la présence du mutant R1432G entraîne une dégradation excessive des canaux en cas de stimulation de l autophagie, et ceci n est pas dépendant de la présence de la sous-unité .
Ce n’est pas le mutant R G qui induit l’activation de la réponse UPR via la voie PERK, mais l’absence de la sous-unité . Ces résultats mettent en évidence le rôle potentiellement protecteur de cette sous-unité auxiliaire vis-à-vis de l’agrégation des protéines mal conformées. Une suractivation de la voie autophagique permet ainsi de remédier à l’induction d’un stress réticulaire.