1- Un modèle d’expression hétérologue
L ensemble des études étant menées sur la lignée cellulaire que sont les (EK- 293T, il convient de reprendre brièvement les caractéristiques de ce modèle cellulaire.
En 1977, Graham et al. ont généré la lignée HEK-293 à partir de cellules embryonnaires de rein humain en les transformant par un adénovirus de type 5 (Graham et al., 1977). Ces cellules ainsi immortalisées présentent des caractéristiques morphologiques de type épithélial et forment des monocouches lorsqu elles sont mises en culture à confluence. Il faut noter qu en , des travaux menés par l équipe de Graham ont suggéré que les HEK293 auraient en réalité une origine neuronale. En effet, ils ont mis en évidence l expression de neurofilaments et de neurorécepteurs caractéristiques de ce lignage (Shaw et al., 2002).
Le modèle cellulaire utilisé durant ma thèse est une lignée dérivée des HEK-293, les HEK- T, qui ont la particularité d exprimer constitutivement l antigène T de S‡ . Ces cellules permettent la réplication épisomale des plasmides transfectés qui contiennent l origine de réplication S‡ 0. Cette caractéristique en fait un système d expression hétérologue de choix car elle permet d atteindre et de maintenir temporairement ou stablement un niveau élevé d expression protéique, et notamment dans le cadre d études menées sur les canaux ioniques.
2- Choix du modèle
Pour l ensemble de ce travail, l utilisation des cellules (EK T se justifie par leur capacité à assurer l expression, le repliement et l adressage à leur membrane d une grande variété de protéines membranaires incluant les canaux ioniques. En effet, ces cellules offrent une facilité d expression via des méthodes classiques de transfection telles que la technique par le phosphate de calcium ou les agents lipofectants. De plus, elles présentent de faibles niveaux d expression endogène de canaux ioniques. Ces cellules non contractiles plus facilement manipulables que les cardiomyocytes, sont
fréquemment utilisées comme modèle cellulaire pour l étude de l expression membranaire des canaux sodiques cardiaques (Thomas & Smart, 2005 ; Zimmer et al., 2002b ; van Bemmelen et al., 2004 ; Qu et al., 2001).
Dans le cadre de notre étude, il est intéressant d apporter quelques précisions sur les conductances ioniques de cette lignée. Des travaux ont récemment montré que les HEK293 peuvent présenter un courant sodique endogène TTX-sensible qui serait porté par l isoforme Nav1.7 (He & Soderlund, 2010). Cette observation est à mettre en relation avec une autre étude antérieure portant sur l évolution de cette lignée en culture. En effet, les auteurs décrivent l augmentation de la densité d un courant sodique également TTX-sensible avec le temps de culture. Cependant, les amplitudes de courant restant relativement faibles < pA/pF , cette conductance endogène n interfère avec les mesures de courants transitant par les canaux surexprimés de manière transitoire (Kurejova et al., 2007). D autre part, ces cellules sont également connues pour exprimer le variant d épissage B de la sous-unité auxiliaire des canaux sodiques dépendants du potentiel (Moran et al., 2000).
B) Conditions de culture
Les cellules sont cultivées en adhérence dans le milieu de culture Dulbecco s Modified Eagle s Medium DMEM, Lonza supplémenté avec % de sérum de veau fœtal S‡F, Biowest , par mM de L-Glutamine et par 100 µg/mL de streptomycine et 100 unités/mL de pénicilline (Sigma). Les cellules sont incubées à 37°C dans une atmosphère humide à 5% CO2 et % d air. Le milieu est renouvelé toutes les heures.
C) Entretien et conservation
1- Repiquage
Lorsque les cellules sont à 80-90% de confluence, elles sont ré-ensemencées au 1/30èmedans une flasque de culture à bouchon ventilé de cm² afin d entretenir une routine. Les repiquages sont ainsi réalisés tous les 3 à 4 jours.
Après aspiration du milieu, les cellules sont lavées dans du tampon Phosphate Buffer Saline (PBS : KH2PO4 1,5 mM, KCl 2,7 mM, NaCl 137 mM, Na2HPO4 8 mM, pH 7.4)
puis incubées au maximum 3 min en présence de Trypsine-EDTA 0,05% (m/v) (GIBCO) à 37°C. Les cellules étant peu adhérentes, elles se détachent rapidement de leur support sous l action de la trypsine et sont transférées dans un tube contenant du milieu DMEM supplémenté avec 10% de SVF. La suspension cellulaire est alors homogénéisée par pipetage/refoulement afin de bien séparer les cellules. Celles-ci sont ensuite centrifugées à 100 g pendant 5 min. Une fois le surnageant aspiré, le culot cellulaire est repris dans du milieu de culture et la suspension est homogénéisée avant d être distribuée dans une nouvelle flasque de routine avec le volume adéquat. En fonction des expérimentations de biochimie, de biologie cellulaire et/ou d électrophysiologie à réaliser, cette suspension est également répartie dans différents pétris pour des transfections prévues 24 à 48 h post-ensemencement.
2- Congélation
Lors d un repiquage de (EK-293T à un faible passage (entre P8 et P12), les stocks cryogéniques sont renouvelés. Pour cela, le culot cellulaire est repris dans du milieu de culture puis un comptage sur cellule de Malassez est effectué. Le volume de la suspension cellulaire est alors ajusté à une concentration de 1.106 cellules par mL de milieu de culture, préalablement supplémenté avec 10% de DMSO (Diméthyl Sulfoxide, Sigma). 1 mL de cette suspension est rapidement transféré dans des cryotubes qui sont alors placés dans une boîte de congélation progressive à -80°C pendant 24 h. Cette boîte assure une descente en température de -1°C par min, cette vitesse de congélation étant optimale pour limiter la toxicité du DMSO qui est utilisé ici comme cryoprotecteur et également pour empêcher la formation de glace intracellulaire. Le lendemain, les cryotubes sont finalement transférés dans un container contenant de l azote liquide à - °C jusqu à décongélation.
3- Décongélation
Au-delà d un certain nombre de passages, les cellules HEK-293T sont exposées à un risque de dérive génétique avec modification de leur morphologie et de leur caryotype. Afin d éviter d introduire un biais lié directement au modèle, de nouvelles
cellules sont décongelées lorsque le nombre de repiquages est supérieur à 30. Les cryotubes contenant les cellules sont alors sortis de l azote puis l aliquot cellulaire est rapidement remis en suspension dans 19 mL de milieu de culture préalablement chauffé à 37°C. Les cellules sont ensuite centrifugées 5 min à 100 g, remises en suspension dans 15 mL de milieu de culture et transférées dans une flasque de culture de 75 cm² avant d être placées dans l incubateur. Le milieu est renouvelé au bout de h afin d éliminer toute trace de DMSO.
D) La lignée stable Nav1.5
Une lignée stable HEK293T surexprimant les canaux Nav1.5 nous a été gracieusement donnée par Mohamed Chahine (Université Laval, Québec, Canada). Les conditions de culture sont similaires à celles de la lignée HEK293T. Il faut noter que ces cellules sont trypsinisées avant d atteindre un taux de confluence trop élevé, inférieur à %, pour prévenir la perte d expression des canaux sodiques. Cette précaution permet de ne pas incuber en permanence les cellules en présence d un milieu de culture sélectif contenant de la généticine (500 µg/mL, GIBCO).