La configuration cellule entière

1- Principe

Les enregistrements effectués en configuration cellule entière permettent de mesurer les propriétés électriques globales de toute la membrane cellulaire, et notamment le potentiel membranaire ou le courant global transitant au travers de tous les canaux ioniques présents à la membrane : il s agit respectivement des modes de courant imposé (current clamp) et de potentiel imposé (voltage clamp).

Cette configuration est obtenue à partir de la configuration cellule-attachée. En effet, après obtention d un « Gigaseal », une aspiration supplémentaire est appliquée à l intérieur de la pipette afin de rompre la portion de membrane située en dessous de son extrémité. Le milieu intra pipette se trouvant alors en contact direct avec le milieu intracellulaire, va diffuser et s équilibrer. Après correction du potentiel de jonction ‡j, le potentiel membranaire Vm équivaut donc au potentiel imposé par la pipette, Vpip.

2- Schéma électrique

La configuration cellule entière implique la rupture de la membrane sous une pipette d un diamètre et d une forme déterminés, et ce avec une qualité de perforation dépendant également de l état des membranes. †ne fois que le milieu intra pipette rentre en contact avec le cytosol, une voie physique se crée, où passent les ions selon leurs gradients de concentration.

La cellule de par les propriétés isolantes de sa bicouche lipidique, peut être assimilée électriquement à un circuit RC, avec deux constituants placés en parallèle, une résistance Rm et une capacité membranaire Cm (Figure 22).

Figure 22 : Représentation schématique du circuit électrique équivalent en configuration cellule entière.

Vp, Rp et Cp indique respectivement le potentiel, la résistance et la capacité de la pipette de patch. Rm et Cm correspondent la résistance et la capacité membranaires placées en parallèle et Raccès, la résistance d accès entre la pipette et le milieu intracellulaire une fois le bris réalisé. Rfuite fait référence à la résistance de fuite dépendant principalement de la qualité du scellement entre la membrane et la pipette (Modifiée d après Conforti, 2012).

En considérant la cellule et la pipette sur un plan électrique, nous pouvons définir des composantes résistives :

- Rp, la résistance de la pipette liée au diamètre de son extrémité,

- Raccès, la résistance d accès dépendant de l obstruction de la voie ouverte après rupture de la membrane,

- Rfuite, la résistance de fuite caractérisant le scellement de la membrane sur la pipette, - Rm, la résistance membranaire de la cellule,

- Rs, la résistance série correspondant à la combinaison des résistances Rp et Raccès placées en série.

3- La capacité membranaire

La membrane se comporte comme un condensateur de capacité Cm exprimé en farad (F), capable de cumuler des charges positives et négatives à son interface après application d un saut de potentiel. La pipette en verre peut également être assimilée à un condensateur de par sa nature isolante.

Lors du passage de la configuration cellule attachée à celle de cellule entière, une stimulation Δ‡ d une durée de Δt appliquée à la pipette charge le circuit RC. †n courant

transitoire est alors visualisable en début et en fin de stimulation, ce sont les courants capacitifs Ic (Figure 23). Du fait de leur cinétique rapide de l ordre de ms , il est nécessaire de les compenser pour éviter qu ils ne se superposent à d autres signaux correspondant à des évènements rapides tels que les courants sodiques.

Ce courant Ic décroît progressivement de manière exponentielle en fonction de la constante de temps τ tel que τ = Rs x Cm pour un potentiel imposé n activant aucun courant ionique. La compensation du courant capacitif dépend donc de celle de la composante résistive Rs et de la composante capacitive Cm. Dans nos conditions de patch clamp, seules les cellules dont le bris a abouti à une résistance Rs inférieure à 4 MΩ sont utilisées pour les enregistrements de courant, l estimation de la valeur de Rs étant effectuée lors de la compensation du courant capacitif.

Figure 23 : Traces représentatives du potentiel de membrane et du courant capacitif résultant lors de l’application d’une stimulation en configuration cellule entière.

Une stimulation (P) d amplitude Δ‡ et de durée Δt appliquée via la pipette à la cellule, engendre une variation de potentiel membranaire progressive (a) du fait de la charge du condensateur. Cette évolution est exponentielle et suit la loi V = Vref . (1-e-t/τ) avec τ la

constante de temp τ = Rs x Cm. Lors de l annulation du créneau de potentiel, la membrane se décharge de Vref vers 0 selon la loi V = Vref . e-t/τ. Les courants capacitifs transitoires de

charge et de décharge résultants (b) permettent de déterminer les valeurs de Rs et de Cm à partir du pic de courant instantané Iin et de τ D après Joffre, 2001).

La compensation de la capacité membranaire, la capacité de la pipette étant considérée comme négligeable en configuration cellule entière, permet d estimer Cm qui

équivaut au rapport ΔQ/Δ‡ avec ΔQ, la quantité de charges déplacées (en coulomb) lors de l imposition d un potentiel Δ‡ incrément de potentiel en m‡ .

La capacité membranaire Cm reflétant la surface membranaire de la cellule, les courants mesurés à partir de chaque cellule peuvent ainsi être normalisés en rapportant chaque valeur de courant sur la valeur de Cm correspondant. Par conséquent, les résultats des enregistrements sont exprimés en densité de courant en pA/pF, ce qui permet de s affranchir de la taille des cellules, avec laquelle varie la densité des canaux membranaires exprimés.