1. Régulation de l’expression des PADs
L’analyse de l’expression des gènes PADI 1 à 4 a permis de montrer qu’ils sont régulés, comme de nombreux gènes, par la liaison de divers facteurs de transcription au niveau de leur promoteur minimal, long respectivement de 195, 132, 129 et 348 pb. Les facteurs ubiquistes Sp1/Sp3 apparaissent nécessaires à l’expression de ces différents gènes et régulent l’activité de chaque promoteur, en coopération avec d’autres facteurs ubiquistes, tels que MZF1 (myeloid zinc finger) pour le promoteur de PADI1, NF-Y pour le promoteur de PADI3, et NF-Y ainsi que des facteurs de la famille AP-1 pour le promoteur de PADI4 (Dong et al., 2005, 2006, 2007a, 2007b ; Figure 47).
L’étude d’une séquence non codante intergénique conservée entre l’homme et la souris a de plus permis l’identification de sites de contrôle à longue distance des gènes PADI1 et PADI3 (Figure 48A). Un activateur transcriptionnel (de type « enhancer »), nommé PIE (pour « PADI intergenic enhancer ») et localisé à 86 kb du promoteur de PADI3, est notamment capable d’activer la transcription de ce gène en présence d’une concentration élevée de calcium, via la formation d’une très large boucle chromatinienne (> 80 kb) et la fixation des facteurs c-Jun et c-Fos de la famille AP-1 (Chavanas et al., 2008 ; Figure 48B). De plus, deux autres activateurs transcriptionnels à longue distance, nommés PIE- S1 et PIE-S2, peuvent agir en synergie pour activer la transcription de PADI3 et probablement celle de
PADI1. En fonction de l’état de différenciation des kératinocytes (directement lié à la présence de
calcium dans le milieu), la fixation différentielle de c-Jun et Jun D sur le site AP-1 de PIE-S2 permet la régulation de PADI3. Dans les kératinocytes les plus différenciés, la fixation de c-Jun sur le site PIE-S2
active la transcription de PADI3 en interagissant de manière concomitante avec des facteurs de transcription MIBP1/RFX1 recrutés sur le site PIE-S2 et avec la boîte TATA du promoteur minimal de
PADI3. Dans les kératinocytes prolifératifs, la fixation de Jun D au site PIE-S2 empêche cette
activation (Adoue et al., 2008 ; Figure 48C). Par ailleurs, une étude a mis en évidence la régulation de l’activité du promoteur de PADI1 via la fixation des sous-unités p50 et p65 de la famille des facteurs de transcription NF-kB au niveau d’un site localisé dans le premier intron du gène. Une fois fixé, l’hétérodimère p50/p65 interagit avec des éléments du promoteur en formant une boucle chromatinienne et augmente ainsi son activité (Ying et al., 2010). Aussi, dans des lignées cellulaires d’astrocytome (cancer du système nerveux central), le facteur de transcription p53, l’un des suppresseurs de tumeurs les plus importants, est capable d’accroître l’expression du gène PADI4 en se fixant sur une séquence située dans le premier intron de PADI4 et nommée p53BS-A (Tanikawa et
al., 2009).
Figure 47 : Promoteurs minimums des gènes PADI 1, 2 et 3 et les facteurs de transcription capables de s’y lier. D’après (Adoue, 2008).
Figure 48 : Régulation transcriptionnelle à longue distance des gènes PADI1 et PADI3. (A) Région intergénique
IG1 non codante et conservée entre l’homme et la souris contenant des sites de contrôle à longue distance des gènes PADI1 et PADI3. (B) Modèle schématique de régulation à longue distance du gène PADI3 par l’activateur transcriptionnel PIE : une stimulation calcique des kératinocytes en culture induit la fixation de c-Jun et/ou cFos sur les sites AP-1 de PIE qui par repliement de la chromatine interagissent avec le complexe de transcription fixé sur le promoteur proximal de PADI3, stimulant la transcription du gène. (C) Modèle schématique de régulation à longue distance du gène PADI3 par la coopération des activateurs PIE-S1 et PIE-S2 : dans les kératinocytes prolifératifs (faible concentration en calcium), JunD se lie à PIE-S1 sans augmentation d’activité du promoteur de PADI3 alors que dans les kératinocytes différenciés (haute concentration en calcium), c-Jun remplace JunD sur PIE-S1 augmentant ainsi l’activité du promoteur de PADI3 probablement via une interaction avec le complexe MIBP1/RFX1 lié à PIE-S2 et avec la boîte TATA du promoteur proximal. D’après (Adoue, 2008 ; Chavanas et al., 2008 ; Adoue et al., 2008).
En outre, d’autres facteurs tels que le calcium, la vitamine D ou encore les œstrogènes sont impliqués dans la régulation de l’expression transcriptionnelle des gènes PADI.
Diverses études ont montré que le calcium, qui régule la différenciation épidermique, induit une augmentation de l’expression des gènes PADI 1, 2 et 3 dans des kératinocytes primaires humains en culture monocouche. En effet, dès 24 heures de culture en présence de 1,2 ou 1,5 mM CaCl2 (contre
0,2 mM pour la condition contrôle), les taux d’ARNm des PADs 1, 2 et 3 sont augmentés (Dong et al., 2005, 2006, 2007a ; Chavanas et al., 2008 ; Adoue et al., 2008). Une de ces études a de plus montré qu’il faut cultiver les kératinocytes à haute concentration calcique pendant au moins 96 heures pour observer une augmentation de la détection de PAD1 en western blot (Dong et al., 2007a). L’expression protéique des PADs 2 et 3 n’a jamais été analysée dans ces conditions.
De même, un traitement de 24h à la vitamine D, qui régule la différenciation épidermique en agissant en synergie avec le calcium (voir paragraphe I.D.2.c), stimule l’expression des gènes PADI 1,
induire la synthèse des protéines (Méchin et al., 2010). Par contre, la densité cellulaire, autre modèle d’induction de la différenciation des kératinocytes, augmente le taux d’ARNm et de protéines des isotypes 1 et 3 alors qu’elle ne modifie pas l’expression de la PAD2 (Méchin et al., 2010). Dans les kératinocytes, l’expression des PADs semble donc être corrélée au taux de différenciation des cellules, ce qui est en accord avec leur profil d’expression épidermique (voir paragraphe IV.F.1.b).
Par ailleurs, dans les cellules tumorales mammaires MCF-7, l’expression de PADI4 est induite par les œstrogènes, via la fixation du récepteur aux œstrogènes ER-α sur deux éléments situés en amont du promoteur du gène PADI4, et également via une augmentation de la fixation des facteurs de transcription AP-1, Sp1 et NF-Y sur le promoteur minimal du gène (Dong et al., 2007b). De plus, il a été démontré qu’une injection d’œstradiol à des souris ayant subi une ovariectomie augmente la quantité d’ARNm des Pads 1 et 2 de manière dose dépendante (Takahara et al., 1992).
Les facteurs impliqués dans la régulation de l’expression de PADI6 n’ont été que peu explorés. Néanmoins, le facteur de transcription Sp1 semble nécessaire à son expression dans les ovaires des truies (Xia et al., 2016).
2. Régulation de l’activité des PADs
Comme nous l’avons vu lors de la description de la structure des PADs (paragraphe IV.C.2), le calcium est indispensable à leur activité. De plus, une étude in vitro réalisée par Méchin et al. a montré que les 3 PADs exprimées dans l’épiderme ne présentent pas la même sensibilité au calcium. L’isotype nécessitant le moins de calcium pour être efficace à 100% est la PAD1 alors que celui qui en exige le plus est la PAD2 (Méchin et al., 2005). De manière intrigante, la concentration en calcium nécessaire pour activer les PADs in vitro est très forte en comparaison à la concentration calcique intracellulaire. Slade et al. ont montré dans leur analyse de la structure cristallographique de la PAD2 que les sites de fixation du calcium Ca3-5, regroupés au sein d’une région du domaine amino- terminal, présentent une affinité pour le calcium bien plus faible que les sites Ca1 et Ca6. Ces derniers gouverneraient ainsi l’ensemble de la dépendance au calcium de la PAD. Il a été proposé que d’autres protéines puissent se lier à cette région et agir comme co-activateurs en augmentant l’affinité de ces sites pour le calcium in vivo (Slade et al., 2015). En accord avec cette hypothèse, une
étude a démontré que la fixation d’un auto-anticorps anti-PAD4 sur une région proche des sites Ca3- 5 de la PAD4 diminue significativement la concentration en calcium nécessaire à son activation in
vitro (Darrah et al., 2013).
La température et le pH influencent aussi l’activité des PADs in vitro. La PAD3 est particulièrement sensible au pH puisqu’une élévation trop importante de celui-ci (au-dessus de 8) engendre une diminution significative de son activité (Méchin et al., 2007).
D’autre part, les PADs 1 à 4 sont capables de s’auto-désiminer in vitro, ce qui réduit leur efficacité
(Méchin et al., 2010 ; Andrade et al., 2010). L’auto-désimination de la PAD4 a aussi été observée in
vivo (Andrade et al., 2010). Une approche in silico, utilisant un modèle tridimensionnel de la PAD3
(généré en utilisant les coordonnées atomiques de la structure cristallographique de la PAD4) sur lequel les arginines les plus accessibles ont été substituées par des citrullines, a permis de montrer que l’auto-désimination de cet isotype induit des changements structuraux discrets, en particulier au niveau du site actif, qui sont probablement responsables de la réduction d’activité observée (Méchin
et al., 2010 ; Figure 49). Une autre étude rapporte de même un changement de la position d’acides aminés clés du site actif suite à l’auto-désimination de la PAD4 par modélisation in silico. Les auteurs proposent ensuite, suite à des analyses de cinétique enzymatique, que l’auto-désimination de la PAD4 ne change pas son activité ni sa sensibilité au calcium, mais réduit son affinité pour certaines protéines cibles (Slack et al., 2011b), ce qui a pour conséquence de réduire son efficacité. L’auto- désimination pourrait donc jouer un rôle clé dans la régulation des PADs.
Figure 49 : Effet de l’auto-désimination sur la conformation du site actif de la PAD3. Modèle tridimensionnel
du site actif de la PAD3 généré in silico. À gauche : forme inactive en absence de calcium, au milieu : forme active en présence de calcium et sans auto-désimination, à droite : forme active auto-désiminée. L’auto- désimination engendre une modification de la position des quatre acides aminés majeurs pour l’activité catalytique et induit un élargissement du site actif. Les distances séparant les différents acides aminés du site actif sont indiquées en picomètres. D’après (Méchin et al., 2011).
Enfin, un inhibiteur cellulaire de la PAD4 a tout récemment été identifié. Il s’agit de PTPN22 (protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22). Dans des macrophages de souris déficientes en Ptpn22, le taux de désimination des protéines est fortement augmenté comparativement à celui des macrophages de souris sauvages. De plus, il a été montré que la surexpression d’une forme recombinante de PTPN22 humaine dans ces cellules inhibe l’activité de la PAD4 en interagissant avec celle-ci, et son action est indépendante de son activité phosphatase (Chang et al., 2015). À ce jour, on ne sait pas si PTPN22 régule l’activité des autres PADs in vivo, ni s’il est exprimé dans les kératinocytes.