I.3. La spectrométrie de masse pour l’analyse des protéines 36
I.3.4. La quantification par LC-MS 59
I.3.4.2. La quantification des peptides et des protéines par LC/MS 62
En spectrométrie de masse, la molécule est analysée sous une forme ionisée et pour la quantifier, le détecteur enregistre l’intensité du signal associé à cette espèce (de rapport m/z) en fonction du temps. On obtient alors un chromatogramme dont l’abscisse est le temps et l’ordonnée est l’intensité de l’ion considéré. Différents modes peuvent être utilisés, comme détaillé dans la partie I.3.3.2 : le mode MS/MS (SRM), ou le mode MS simple.
Comme pour tous les détecteurs, la quantification est réalisée au moyen d’une droite d’étalonnage, en prenant garde à se restreindre à des concentrations en analyte comprises dans le domaine de linéarité du spectromètre de masse. En raison de la complexité de ce dernier, il existe de nombreux paramètres susceptibles de faire varier l’intensité d’un ion au cours des différentes analyses, et ce détecteur est donc moins robuste que d’autres pour la quantification. Pour pallier ces variations, une molécule ayant des caractéristiques physico- chimiques aussi proches que possible de l’analyte est utilisé : le standard interne. Son rôle est de s’affranchir des fluctuations d’une analyse à l’autre. Il est introduit en quantité constante dans les échantillons à analyser et les points de gammes. Pour réaliser la quantification, l’aire absolue du pic chromatographique de l’analyte n’est pas utilisée directement mais est normalisée par l’aire du pic chromatographique du standard interne.
Toute méthode analytique doit être caractérisée et validée pour garantir la robustesse des résultats obtenus. Dans le cadre de l’évaluation des médicaments en phase de développement, ces résultats font parti des données soumises aux autorités réglementaires, et doivent donc être acquises conformément aux bonnes pratiques de laboratoires (BPL), et les méthodes utilisées doivent suivre les recommandations formulées par la FDA (Food and Drug Administration)
87;88.
La courbe de calibration doit ainsi contenir un minimum de cinq points de gamme (sans compter le blanc), et doit être obtenue à partir de solutions préparées dans la même matrice biologique que les échantillons pour lesquels la méthode sera appliquée.
La limite basse de concentration (LLOQ pour lower limit of quantification) est la concentration la plus basse pour laquelle il est possible de faire une mesure avec une précision et une justesse statistiquement acceptables. Le plus haut point de gamme définit la ULOQ (upper limit of quantification). Toute concentration obtenue en dehors de ces limites basses et hautes ne peut être acceptée (pas d’extrapolation possible).
La justesse et la précision de la méthode pour analyser des échantillons de concentration connue sont évaluées à l’aide de contrôles de qualité (CQ). Trois concentrations réparties sur toute l’amplitude de la gamme sont testés : un CQ bas (à une concentration inférieure à 3× la LLOQ), un CQ moyen (au milieu de la gamme) et un CQ haut (près de la ULOQ). Lors de la validation d’une méthode, précision et justesse sont déterminées en utilisant un minimum de cinq répétitions par niveau de concentration. Leur valeur moyenne ne doit pas dévier de plus de 15 % par rapport à la valeur théorique, excepté pour la LLOQ, où elle ne doit pas dévier de plus de 20 % par rapport à la valeur théorique. Quant à la précision, le coefficient de variation de la valeur obtenue ne doit pas dépasser 15 %, excepté à la LLOQ, où la tolérance est là encore de 20 %. Il est également recommandé, lors du développement d’une méthode devant satisfaire les recommandation BPL, d’évaluer la stabilité de la molécule dans la matrice biologique, dans les conditions de stockage mais aussi à température ambiante, d’évaluer l’effet de congélations et de décongélations répétées sur la stabilité du produit, ainsi que d’estimer la spécificité du dosage en utilisant plusieurs sources de la même matrice (des plasma de donneurs différents par exemple). Par la suite, lors de l’application de la méthode à des échantillons inconnus, une courbe de calibration dans la même matrice doit être générée pour chaque lot d’échantillons, et les CQ sont utilisés pour accepter ou rejeter l’analyse.
Dans les chapitres suivants, nous avons développé des méthodes analytiques adaptées à différentes protéines thérapeutiques et à des biomarqueurs. Nous avons évalué les méthodes à l’aide de certains critères présentés ici. Cependant, le principal but de ces développements étant de prouver la faisabilité des méthodes analytiques développées, certaines recommandations n’ont pas été appliquées. En particulier, lorsque des dosages des molécules cible avaient déjà été développées, les études de stabilité n’ont pas été réalisées de nouveau.
Chapitre II :
Evaluation d’un polypeptide thérapeutique
II.1. Introduction
Dans le cadre de l’évaluation des protéines thérapeutiques, nos premiers travaux ont porté sur l’étude dans le plasma d’une petite protéine : l’Epi-hNE4 (Engineered protein inhibitor of
human Neutrophil Elastase) 89;90. Cette protéine, également dénommée DX-890, est un inhibiteur spécifique de l'élastase leucocytaire humaine (hNE), découvert et conçu par Dyax. Elle est actuellement en développement, et testée sous licence en Europe par Debiopharm. L'élastase leucocytaire humaine (hNE) est une protéase produite dans le cadre d'une réponse inflammatoire d'une catégorie de leucocytes, appelés neutrophiles, qui combattent l'infection en dégradant les protéines de surface de certaines bactéries. Une accumulation excessive de hNE dans les liquides et tissus pulmonaires de patients atteints de mucoviscidose peut compromettre la structure et le fonctionnement des poumons car cette enzyme est capable de dégrader les macromolécules constituantes de la matrice extracellulaire des poumons , et est susceptible d’induire des inflammations 91.
L’EPI-hNE4 est une petite protéine de 56 acides aminés, ayant une masse moléculaire de 6237 Da. Sa structure dérive d’un inhibiteur endogène humain de protéases (inhibiteur inter α). C’est un inhibiteur rapide et de forte affinité pour son récepteur hNE, avec une constante de dissociation Kd de 5,45 × 10-12M et une constante cinétique Kon de 8 × 106M-1s-1.
Sa séquence d’acides aminés est la suivante :
1 EACNLPIVRG PCIAFFPRWA FDAVKGKCVL FPYGGCQGNG 41 NKFYSEKECR EYCGVP
Nous nous sommes intéressés à deux aspects de la bioanalyse de cette protéine dans le plasma, dans le but de mieux caractériser sa pharmacologie. Nous avons ainsi, dans un premier temps, effectué sa quantification dans des échantillons obtenus lors d’une étude clinique. Pour cela nous nous sommes basés sur une méthode de dosage mise au point au laboratoire, dont nous avons voulu augmenter la sensibilité via une étape d’immunocapture. Ce travail a été publié dans Rapid Communication in Mass Spectrometry 92. Nous avons ensuite travaillé sur un problème majeur dans le domaine des médicaments biopharmaceutiques : l’immunogénicité. Nous avons alors développé un dosage immunologique pour détecter la présence d’anticorps anti-Epi-hNE4 dans le sérum de singe
lors d’une étude de toxicité menée chez cette espèce. Cette étude a été publiée dans Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis 93.