Les sources électrospray (ESI : ElectroSpray Ionisation) 43

L’électrospray (ou électronébulisation) est une source d’ions à pression atmosphérique (Figure 13) qui peut facilement être couplée à la chromatographie liquide. Cette technique, proposée par M. Dole60 en 1968, a été développée par J.B. Fenn 52 au milieu des années 80 et est utilisée en spectrométrie de masse pour produire des ions à partir de composés en solution. Considérée au début comme une source de désorption-ionisation dédiée à l’analyse de polymères, et appliquée ensuite aux protéines, son utilisation s’est rapidement élargie non seulement à d’autres biopolymères, mais également à l’analyse de petites molécules. Cette technique d’ionisation-désorption, n’induit quasiment pas de fragmentation. C’est la raison pour laquelle la méthode électrospray est considérée comme une technique d'ionisation- désorption douce.

Figure 13 : Photographie d’une source electrospray (Thermo)

Les mécanismes conduisant à la formation d'ions en phase gazeuse par electrospray peuvent être résumés en trois étapes principales: (1) la formation de gouttelettes chargées à partir de l’extrémité d'un capillaire métallisé, (2) l’évaporation du solvant et les explosions coulombiennes, (3) formation d’agrégats chargés, (4) et finalement obtention d’ions désolvatés en phase gazeuse (positifs, négatifs et adduits, en fonction du mode d’ionisation).

Formation de gouttelettes chargées à l’extrémité d'un capillaire métallisé :

L’électrospray est produit par application à pression atmosphérique d’un fort champ électrique sur un liquide traversant un tube capillaire métallique (ou une aiguille métallisée) avec un faible débit (0,1 à 500 µL.min-1). Le champ électrique est obtenu par application d’une différence de potentiel de plusieurs kilovolts (de 2 à 6 kV) entre le capillaire et la contre électrode. La grande différence de potentiel induit une séparation des charges à l'intérieur du liquide par un phénomène électrophorétique de migration des électrolytes (cations et anions). Lorsque le capillaire représente l’électrode positive, les espèces cationiques vont alors s’accumuler à son extrémité, tandis que les anions vont effectuer un déplacement inverse en s’accumulant à l’intérieur, jusqu’à s’oxyder à la surface du capillaire 61.

Figure 14 : Schéma simplifié du fonctionnement d’une source électrospray 61

L’accumulation de charges à la surface du liquide situé à l’extrémité du capillaire va créer une déformation de ce dernier, déformation qui met en jeu un équilibre entre les forces électrostatiques et la tension de surface de ce liquide. Lorsque les forces électrostatiques atteignent la valeur de la tension de surface du liquide, la déformation est conique et porte le nom de cône de Taylor62. Une faible augmentation du champ électrique suffit alors pour déstabiliser le cône qui se rompt à son extrémité, dispersant la solution en nombreuses gouttelettes fortement multichargées. Après cette étape, les gouttelettes se déplacent sous l’influence du champ électrique intense mais également sous celle du gradient de pression créé entre la source et l'entrée du spectromètre de masse. C’est au cours de ce trajet qu’a lieu l’évaporation du solvant des gouttelettes pour produire des agrégats chargés.

Processus d’évaporation du solvant et explosions coulombiennes :

Dans l’espace entre l’extrémité du capillaire et la contre-électrode, les gouttelettes chargées issues du cône de Taylor vont être au contact de l’azote chauffé et vont subir une évaporation du solvant. La diminution du rayon R des gouttelettes possédant une charge constante q conduit à l’augmentation de la densité de charge et à la répulsion électrostatique jusqu’à ce que les gouttelettes atteignent la limite de stabilité, liée à la tension de surface et donnée par l’équation de Rayleigh:

3 0

8 R

q= π ε γ

Équation 1 : équation de Rayleigh, avec ε0 permittivité du vide, R le rayon de la gouttelette et γ la tension

de surface

Cette équation donne les conditions pour lesquelles les forces de répulsion électrostatiques deviennent égales à celles de la tension de surface. Ainsi, la gouttelette chargée devient instable et une cascade d’explosions coulombiennes se produit (fission des gouttelettes) 63;64. Ce phénomène se reproduit jusqu’à ce que les nouvelles gouttelettes aient à nouveau atteint la limite de Rayleigh.

Formation d’ions désolvatés en phase gazeuse à partir de petites gouttelettes fortement chargées :

Deux mécanismes principaux sont proposés pour expliquer ce phénomène. Le premier, le modèle des résidus chargés ou « charged residue model » (CRM) a été décrit par Dole60 en 1968. Celui-ci a fait l’hypothèse que la succession d’explosions coulombiennes conduit à des gouttelettes de plus en plus petites jusqu’à ce que la dernière « gouttelette » ne possède plus qu’un seul et unique ion (Figure 15). La désolvatation du solvant résiduel présent sur les ions permet de ce fait l’obtention d’ions multichargés en phase gazeuse.

Figure 15 : Deux théories de l’obtention d’ions désolvatés en phase gazeuse à partir de gouttelettes chargées – (a) Modèle des résidus chargés par Dole – (b) Modèle de l’évaporation ionique par Iribarne et

Thomson

En 1979, une seconde théorie, le modèle de l’évaporation ionique ou « ion evaporation

model » (IEM), basée sur de nouveaux mécanismes, est proposée par Iribarne et Thomson 65. Leur théorie repose, comme celle de Dole, sur une succession initiale de fissions de type coulombiennes qui réduit la taille des gouttelettes en augmentant leur densité de charge. La

différence avec la théorie de Dole tient au fait qu'Iribarne et Thomson proposent que lorsque les gouttelettes atteignent un rayon très petit (de l’ordre de 10 nm) et une densité de charge très élevée, le champ électrostatique à leur surface est assez intense pour expulser directement des ions en phase gazeuse (Figure 11b). Ce phénomène, appelé ″évaporation ionique″, suggère que l’explosion coulombienne ne constitue pas le seul mécanisme majoritaire pour les petites gouttelettes de rayon R ≤ 10 nm.

D’autres modèles basés sur les précédents existent, mais aucun d’entre eux n’est aujourd’hui considéré comme la théorie unique qui permettrait de modéliser le passage de gouttelettes de solvant contenant des analytes à des ions en phase gazeuse 66. Cependant, il semble actuellement établi que le modèle de Dole 67-69 expliquerait le processus de désorption/ionisation pour les macromolécules et le modèle d’Iribarne et Thomson celui des molécules de petite taille 65. Quel que soit le mécanisme responsable de la formation des ions en phase gazeuse, l'électrospray est aujourd'hui une méthode d'ionisation-désorption couramment utilisée, dans des domaines variés (biologie, chimie, pharmacie…) et notamment dans l’étude des peptides et protéines.

Les particules chargées ainsi produites dans la source sont accélérées vers l’analyseur, alors que les molécules non chargées sont éliminées. Il existe différentes géométries de source, où le capillaire porté à haute tension fait un angle avec la contre électrode. La géométrie Z-spray est assez répandue chez un type de constructeur par exemple (Waters). Suivant les appareils, cet angle peut être variable ou constant, et il est parfois possible de désaxer le spray par rapport à l’entrée de l’analyseur. Ainsi seules les molécules ionisées sont déviées de leur trajectoire pour rentrer dans l’analyseur. Les molécules non chargées ne viennent pas se déposer, ce qui évite l’encrassement de la contre électrode et des lentilles de transfert. Ces paramètres sont importants dans les applications de routine et en couplage chromatographique à haut débit, où le premier échantillon d’un lot doit être analysé dans des conditions similaires au premier, sans perte de rendement d’ionisation ou de transmission des ions.

Les ions multichargés :

Après ionisation à partir de gouttelettes chargées, les macromolécules telles que les protéines sont libérées à l’état gazeux après désolvatation. Le processus conduit à la formation d’une multiplicité d’ions portant un nombre variable de charge. Cette distribution de charges porté par une macromolécules dépend du nombre de sites acides ou basiques, de la conformation de

la protéine (globulaire ou dépliée), de la nature du solvant et de son pH. La complexité du spectre est en fait un avantage car la précision de la mesure en est accrue, et la formation d’ions multichargés permet l’analyse de molécules de masse moléculaires très élevées à l’aide d’analyseurs ayant une faible valeur limite en masse nominale. En effet, les principes physiques de séparation des ions par spectrométrie de masse font que la grandeur mesurée ne correspond au rapport masse sur charge (m/z). Les spectres de masse ESI de macromolécules correspondent à une distribution d’états de charges dont les pics correspondent à des états de charge consécutifs obtenus par protonation (M+zH)z+ ou déprotonation (M-zH)z-. Dans le cas d’une ionisation en mode positif, deux pics consécutifs ont des rapports m/z

( )

( )

(

)

m H _{, où M est la masse moléculaire de la}

molécule, mH la masse du proton et z l’état de charge du pic considéré. La résolution de ce

système permet d’accéder facilement à z et surtout à M. Des algorithmes de déconvolution ont ont été développés pour transformer l’échelle des spectres de masse en masses réelles. L’état de charge peut être également déterminé par l’écart entre chaque pic de l’amas isotopique. Les isotopes du 12C et 13C diffèrent d’une unité de masse, la distance observée sur un spectre entre deux pics isotopiques consécutifs correspond à 1/z. Cette manière de déterminer la charge d’un ion est importante pour les ions fragments obtenus dans les expériences de MS/MS. Grâce à l’ionisation-désorption par MALDI ou par ESI, la spectrométrie de masse a pû être appliquée à l’étude des macromolécules biologiques. La méthode MALDI se fait sur matrice solide, sous vide et a le principal avantage de créer des ions peu chargés. C’est une méthode d’ionisation séquentielle, très souvent couplée avec un analyseur de type temps de vol (configuration MALDI-TOF), dont le mode de fonctionnement est également séquentiel et requiert un vide poussé. L’ESI est une méthode d’ionisation en continu et à pression atmosphérique, produisant des ions avec une plus grande distribution de charges qu’en MALDI. L’ESI est une interface permettant de coupler beaucoup plus facilement que le MALDI la chromatographie liquide avec divers analyseurs.