Principe des immunodosages 31

I.2.3.1. Méthodes par compétition

Lorsque l’on met en présence un anticorps (Ac), son antigène (Ag) et ce même antigène marqué (Ag*), il peut se créer deux types de complexe selon que l’anticorps se fixe à l’antigène ou à l’antigène marqué : Ac-Ag et Ac-Ag*. Le principe de ce dosage réside donc dans la compétition entre les deux formes d’antigène. Pour rendre cette technique quantitative, la concentration en anticorps et en molécule marquée est maintenue fixe, et l’augmentation de la concentration en antigène entraîne l’augmentation de la concentration en complexe antigène-anticorps, au détriment de la formation du complexe antigène marqué- anticorps. Ac (fixe) + Ag ( Ag -Ac + Ag* (fixe) Ag* -Ac ) ( ) ) (

Si l’on dispose d’une méthode permettant de séparer, sans modifier l’équilibre de la réaction, les composés libres des complexes antigènes-anticorps et antigènes marqués-anticorps, on peut déterminer, grâce au signal délivré par le marqueur, la concentration de l’antigène marqué dans sa forme libre et/ou dans sa forme complexée à l’anticorps. Suivant la nature du dosage, on peut être amené à ne pouvoir conserver que l’une des deux fractions (antigène libre ou antigène lié). En établissant une courbe d’étalonnage avec des concentrations connues d’antigène, on détermine la concentration en antigène pour une solution inconnue par comparaison au signal mesuré.

La valeur portée en ordonnée peut être soit l’intensité du signal (désintégration nucléaire, absorbance) correspondant à la molécule marquée libre (F*) ou liée à l’anticorps (B*), soit un

ratio d’intensité (B*/F*, B*/B*0 où B*0 est le signal obtenu en absence d’antigène non

marqué).

L’avantage essentiel du dosage par compétition est de pouvoir s’appliquer à n’importe quel type d’antigène, quelle que soit sa taille. C’est en particulier la seule technique permettant de doser les haptènes ne possédant qu’un seul épitope. Cependant, cette méthode nécessite un nombre de sites anticorps constant et identique entre chaque échantillon pour avoir une bonne précision, puisque c’est l’anticorps introduit en défaut qui génère la compétition entre les antigènes. Un deuxième élément limitant pour cette méthode à un seul site de liaison concerne les métabolites et les interférents qui sont susceptibles d’être liés à l’anticorps, et donc de générer un signal qui surestime la quantité d’antigène. Ce manque de spécificité est réduit dans les méthodes immunométriques à deux sites, comme par exemple les méthodes de type sandwich.

I.2.3.2. Méthodes sandwich

Contrairement aux méthodes par compétition, les méthodes de type sandwich utilisent un excès d’anticorps pour lier l’antigène, puis un second anticorps marqué vient se fixer également sur l’antigène pour révéler la liaison entre le premier anticorps et l’antigène. Le premier anticorps peut être par exemple fixé à un support solide (par liaison covalente ou par simple adsorption), et la quantité doit être telle que le nombre de sites de liaison soit supérieur au nombre de molécules d’antigènes présentes dans les solutions étalons ou inconnues. L’antigène va ainsi se fixer sur les sites spécifiques. L’anticorps marqué est ajouté, soit simultanément, soit après une première incubation et un lavage, et se fixe sur l’antigène, préalablement fixé au premier anticorps. L’antigène se trouve ainsi pris en sandwich entre les deux anticorps. Un simple lavage permet de séparer les complexes anticorps-antigène- anticorps marqués des anticorps marqués libres en excès. Pour que l’anticorps marqué puisse se lier à l’antigène déjà engagé dans une réaction avec le premier anticorps, il est nécessaire que les deux anticorps réagissent contre des épitopes différents de l’antigène. On peut employer, à la fois comme anticorps liants et comme anticorps marqués, des anticorps polyclonaux multivalents, ou utiliser des anticorps monoclonaux spécifiques différents. De même que pour les dosages par compétition, les molécules marquées peuvent l’être par exemple par l’intermédiaire de la radioactivité ou par une enzyme. Dans les différents cas de

marquage, le signal correspondant au complexe anticorps-antigène-anticorps marqué est un signal croissant en fonction de la quantité d’antigène, alors que pour un dosage par compétition, le signal correspondant au complexe est une fonction décroissante de la quantité d’antigène.

Les avantages des méthodes de type sandwich sont liés à l’utilisation de deux anticorps (monoclonaux si possibles) dont la spécificité de la reconnaissance pour deux sites différents de l’antigène assure la spécificité de la méthode. Pour fournir un « faux positif » correspondant à une autre molécule confondue avec l’antigène, cette molécule doit posséder les deux même épitopes. En choisissant bien les épitopes, les interférences avec d’autres molécules présentant une forte homologie peuvent être réduites. Cependant, ces interférences restent possibles. Dans un dosage par compétition, les antigènes et les antigènes marqués entrent en compétition pour un nombre limité de sites de fixation portés par les anticorps. La sensibilité maximale est obtenue lorsque la concentration de l’anticorps et de l’antigène marqué tend vers zero, alors que pour le format en sandwich, la sensibilité est maximale lorsque la concentration de ces réactifs tend vers l’infini 39_{. Pour cette dernière technique, les}

réactifs étant introduits en excès, ces conditions favorisent (sur le plan thermodynamique et cinétique) la formation du complexe et améliore la sensibilité 40. Bien que la méthode sandwich soit plus sensible, elle est cependant moins bien adaptée aux haptènes qui sont souvent trop petits pour pouvoir présenter deux épitopes et réagir avec deux anticorps à la fois, même si un dosage sandwich avec deux sites de fixation pour les anticorps a pu être obtenu avec des peptides comprenant seulement 8 acides aminés 40. Pour les peptides ne comportant que quelques acides aminés, un format de dosage proche du sandwich peut être utilisé. Il consiste à lier covalemment le peptide à l’anticorps après immobilisation (par le glutaraldehyde), puis à rompre la liaison anticorps-antigène pour libérer l’épitope. Le peptide lié au support solide est ensuite révélé par le même anticorps marqué 41.