179 2.1.2.2 Préparation du tampon de formation des GUVs

Le tampon utilisé lors de la formation des GUVs est composé de 240mM de saccharose dissous dans de l’eau Milli-Q. La conductance électrique de ce tampon est de 17,1μS/cm.

2.1.2.3. Electroformation des GUVs

Les GUVs sont électroformés entre deux lames de verre recouvertes d’un seul côté d’oxyde d'indium-étain (ITO, Indium Tin Oxide) conducteur. Une bande de cuivre adhésif de 36μm d’épaisseur est collée sur chaque lame et repliée des deux côtés. Du côté non conducteur, un fil électrique est soudé sur le cuivre (cf Figure A- 8). On dépose ensuite 15μL du mélange de solutions lipidiques à la surface de l’ITO sur chacune des lames, à l’aide d’un patron circulaire représentant le joint qui servira à éloigner les deux lames lors de l’application du champ électrique. Les lipides doivent être étalés de la façon la plus homogène possible sur toute la surface. Les deux lames sont ensuite mises sous vide pendant deux heures dans une boîte opaque pour retirer tout résidu de solvant.

Figure A- 8 : Chambre d’électroformation des GUVs, présentant deux compartiments afin de former simultanément deux sortes de vésicules différentes.

(Adapté de [284]).

La formation des GUVs se fait à l’aide de l’application d’un champ électrique[371]. Les deux lames ITO sont superposées, séparées par un joint de silicone (cf Figure A- 8). Les deux câbles électriques sont branchés à la sortie d’un générateur basse tension Exact®. L’amplitude des tensions délivrées par le générateur est contrôlée à l’aide du logiciel Picoscope®. Selon la composition des GUVs souhaitée, les paramètres de formation peuvent différer.

GUVs composés de POPC ou de DPPC : On effectue la formation à 25°C pour le POPC et à 50°C pour le DPPC. Une rampe de tension sinusoïdale de fréquence 8 Hz de 25 mV à 1225 mV est appliquée, en augmentant de 100 mV en 100 mV toutes les cinq minutes. Ensuite, la tension de 1225 mV est maintenue durant une nuit. Puis, une tension carrée de fréquence 4 Hz et d’amplitude 1225 mV est appliquée pendant 1h pour décrocher les GUVs formés. GUVs composés de POPC ou de DPPC avec 20% ou 30% de cholestérol : On effectue la formation à 40°C. Une rampe de tension sinusoïdale de fréquence 8 Hz de 25 mV à 1225 mV est appliquée, en augmentant de 100 mV en 100 mV toutes les cinq minutes. Ensuite, la

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tension de 1225 mV est maintenue durant une nuit. Puis, une tension carrée de fréquence 4 Hz et d’amplitude 1225 mV est appliquée pendant 1h pour décrocher les GUVs formés. Les GUVs ainsi formés mesurent entre 10 et 80μm de diamètre. Une étude menée par Chloé Mauroy [284] a prouvé leur unilamellarité. Ces GUVs peuvent être conservés pendant environ une semaine à 4°C dans des fioles en verre. Les lames ITO sont ensuite nettoyées à l’éthanol et à l’eau, puis séchées pour pouvoir être réutilisées.

2.1.3. Vésicules catanioniques utilisées

Afin d’étudier leur comportement d’interaction avec les GUVs, les vésicules catanioniques de composition suivante sont préparées : TriCat12 seul, TriCat12/FluoCat, TriCat12/Texas Red. Elles sont formulées dans le tampon P (260mM glucose, 1mM Hepes et 1mM NaCl (pH = 7,35)) selon les protocoles décrits précédemment.

2.1.4. Observation par microscopie à contraste de phase et par microscopie de fluorescence

La chambre d’observation est constituée avec une paire d’électrodes parallèles espacées de 1mm. 1,5µL de solution de GUVs de POPC ou de DPPC avec ou sans cholestérol électroformés dans le tampon de saccharose (240mM) sont introduits dans la chambre, ensuite on les dilue dans 50µL de tampon P composé de 260mM de glucose, 1mM d’Hepes et 1mM de NaCl (pH = 7,35), afin de pouvoir les observer en microscopie à contraste de phase. Les vésicules catanioniques sont quant elles introduites juste avant l’observation (t=0). La visualisation optique est réalisée en utilisant un microscope champ large champ PHACO 2 à contraste de phase équipé d’un objectif 40x. Les clichés sont pris par une caméra digitale montée sur le microscope et connectée à un ordinateur. L’illumination des échantillons est réalisée par une lampe à mercure et un miroir dichroïque à la longueur d’onde d’excitation de 488nm, ou par contraste de phase avec une lampe halogène.

Les clichés des GUVs ont été pris avec le logiciel Metavue®. Les profils d’intensité ont été tracés sur un diamètre des vésicules. La membrane lipidique a été détectée par deux pics d’intensité de fluorescence. L’intensité moyenne de fluorescence à l’intérieur des GUVs a été mesurée dans une région d’intérêt comprenant la vésicule.

Lors de l’expérience mettant en évidence le relargage du contenu glucosidique des vésicules catanioniques dans le cœur des GUVs, la perte du contraste de phase a été observée visuellement au microscope à contraste de phase. Environ 300 GUVs ont été photographiés, ceux ayant perdu leur contraste et ceux l’ayant conservé ont été comptés.

2.1.5. Observation par microscopie confocale

Afin de mettre en évidence le relargage dans le cœur aqueux des GUVs du Texas Red (ex =

563nm) encapsulé dans les vésicules catanioniques, l’augmentation de l’intensité de fluorescence dans le cœur des GUVs a été détectée par microscopie confocale. L’appareil utilisé est un microscope confocal inversé Zeiss® LSM 510 Inv avec un objectif à huile 63x et équipé d’un laser Hélium Néon à 543nm. Les profils d’intensité de fluorescence ont été tracés sur les diamètres de 10 GUVs. L’intensité moyenne de fluorescence à l’intérieur des GUVs a été mesurée dans une région d’intérêt comprenant la vésicule. Une moyenne de ces 10 GUVs a été calculée pour déterminer une intensité de fluorescence moyenne. Cette méthode a été utilisée sur les GUVs dans un milieu de Texas Red en solution aqueuse

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