Incorporation de sondes fluorescentes au sein des vésicules catanioniques

Les vésicules catanioniques de TriCat12 sont destinées à encapsuler des principes actifs d’hydrophilie variée. Afin de modéliser ces principes actifs, deux sondes fluorescentes ont été utilisées pour permettre leur suivi par des techniques utilisant cette fluorescence (cf Chapitre III). C’est pourquoi dans un premier temps, nous avons évalué la capacité d’encapsulation et la stabilité physico-chimique des vésicules marquées, puis nous avons vérifié la pertinence du protocole de formulation des vésicules adapté à des applications biologiques sur ces systèmes ainsi chargés.

4.1.

Insertion d’une sonde amphiphile, le « FluoCat »

4.1.1. Insertion de la sonde

Afin de modéliser l’insertion d’un principe actif amphiphile au sein des bicouches des vésicules catanioniques, nous avons utilisé le tensioactif 12-(N-(7(nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol- 4-yl)amino)dodécanoate de 1-N-hexadécylammonium-1-déoxylactitol, désigné ci-après « FluoCat » et développé par E. Soussan lors de sa thèse [60, 330]. Il s’agit d’un tensioactif catanionique formulé à partir de L-Hyd et d’un acide carboxylique porteur du groupement NBD fluorescent (cf Figure II- 17). Leur association a lieu par échange de proton entre l’amine et l’acide carboxylique, à l’instar du TriCat12.

Figure II- 17 : Structure du FluoCat, tensioactif catanionique porteur du groupement fluorescent NBD (encadré).

Cette molécule amphiphile est insérée dans la membrane des vésicules catanioniques de TriCat12 (TriCat12/FluoCat (95 : 5)) sans modification de ses caractéristiques intrinsèques, comme l’avait déjà montré E. Soussan avec le TriCat16 [330]. En effet, la microscopie électronique à transmission permet d’observer des agrégats de morphologie sphérique, vraisemblablement des vésicules, de taille variant approximativement de 80 à 400nm (cf Figure II- 18 (A)). La distribution de taille des agrégats obtenus a été précisée par une étude en diffusion dynamique de la lumière. (cf Figure II- 18 (B)).

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Figure II- 18 : (A) Clichés de MET et (B) distribution de taille des agrégats de TriCat12 / FluoCat (95 : 5) formulés dans l’eau à 25°C ([TriCat12] = 1 x 10-4M).

Au vu des résultats obtenus similaires à ceux des vésicules de TriCat12 pur, il semble nécessaire de confirmer que le tensioactif FluoCat a bien été encapsulé dans les vésicules de TriCat12.

Pour cela, le spectre d’émission de fluorescence reporté sur la Figure II- 19 a été réalisé dans le cas où le FluoCat est formulé en présence de TriCat12 ainsi que lorsqu’il est à l’état libre en solution à la même concentration.

Figure II- 19 : Spectres d’émission de fluorescence dans l’eau à 25°C du FluoCat seul (5,3 x 10-6M) et du mélange TriCat12/FluoCat ((95 : 5), soit 1 x 10-4M et 5,3 x 10-6M respectivement) (ex=488nm).

Ces spectres mettent en évidence un déplacement bathochrome de la longueur d’onde maximale d’émission de fluorescence de 560nm lorsque le FluoCat est libre en solution à 549nm en présence de vésicules catanioniques. De même, le spectre d’absorption UV/Visible traduit lui aussi un effet bathochrome de 488nm lorsque le FluoCat est libre, à 484nm lorsqu’il est en présence de TriCat12. Ces observations révèlent un changement d’environnement de la molécule sonde vers un état plus structuré de la matière [364], traduisant son insertion au cœur de la bicouche des vésicules catanioniques. Les vésicules qui en résultent, désignées ci-après vésicules de TriCat12/FluoCat, possèdent donc des caractéristiques de taille et de morphologie identiques à celles de vésicules de TriCat12 seul.

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4.1.2. Stabilité à la dilution des vésicules de TriCat12/FluoCat

4.1.2.1. Stabilité à la dilution dans le milieu de formulation

Afin de vérifier la stabilité des agrégats supramoléculaires de TriCat12 lors de l’insertion de FluoCat, nous avons suivi le devenir d’échantillons de TriCat12/FluoCat formulés dans l’eau ou le tampon P, avant et après dilution, par diffusion dynamique de la lumière (cf Figure II- 20).

Figure II- 20 : Distribution de taille de vésicules de TriCat12/FluoCat formulées : dans l’eau avant (A) et après (B) dilution dans l’eau ; dans le tampon P avant (C) et après (D) dilution dans le tampon P.

Les vésicules catanioniques sont stables en termes de taille et de morphologie à l’insertion du marqueur FluoCat, lorsqu’elles sont formulées dans l’eau comme dans le tampon P. En effet, après insertion du FluoCat dans leur membrane, les tailles des vésicules catanioniques sont de l’ordre de 200nm dans l’eau et 230nm dans le tampon P, ces différences n’étant pas significatives en considérant la large distribution des valeurs. Leur indice de polydispersité est de l’ordre de 0,2 à 0,4. Par ailleurs, après dilution dans le milieu de formulation, ces données sont conservées, traduisant la stabilité à la dilution des vésicules de TriCat12/FluoCat. Enfin, ces vésicules, diluées ou non, conservent leur intégrité sur une échelle de temps comparable à celle des vésicules de TriCat12 seul.

4.1.2.2. Stabilité à la dilution en milieu physiologique

De même que pour les vésicules de TriCat12 seul, nous envisageons d’utiliser les vésicules de TriCat12/FluoCat pour des applications biologiques, en utilisant le protocole de formulation précédemment mis au point. Pour cela, nous avons vérifié par DDL que les vésicules de TriCat12/FluoCat formulées dans l’eau restent elles aussi stables après dilution dans le tampon PBS et les milieux de culture DMEM, EMEM et RPMI (cf Figure II- 21).

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Figure II- 21 : Diamètres hydrodynamiques des vésicules de TriCat12/FluoCat formulées à 1 x 10-4M dans l’eau puis diluées à 2 x 10-5M dans le PBS, le DMEM, l’EMEM ou le RPMI.

Tout comme dans le cas de vésicules de TriCat12 seul, les vésicules de TriCat12/FluoCat ont un diamètre de 200 à 250nm conservé après dilution dans les milieux physiologiques, ce qui nous permet d’envisager l’utilisation de vésicules de TriCat12/FluoCat en contact avec des cellules.

4.2.

Encapsulation d’une sonde hydrophile, le Texas Red

4.2.1. Choix de la sonde hydrophile

Afin de vérifier la possibilité d’encapsuler des molécules hydrophiles dans le cœur aqueux des vésicules catanioniques, nous avons sélectionné une molécule sonde hydrophile fluorescente. Cette propriété permet de suivre le devenir du contenu intravésiculaire par fluorescence.

Nous avons choisi d’utiliser le sel 9-[2(ou 4)-(chlorosulfonyl)-4(ou 2)-sulfophényl]- 2,3,6,7,12,13,16,17-octahydro-1H,5H,11H,15H-Xanthéno[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']diquinolizin-18- ium, désigné par la suite « Texas Red », dont la structure est décrite dans la Figure II- 22.

Figure II- 22 : Structure du Texas Red.

Il s’agit d’une molécule hydrophile, globalement neutre, dont les charges, peu accessibles stériquement, ne déstabilisent pas l’équilibre de l’association catanionique supramoléculaire constituant les vésicules de TriCat12.

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