93 Enfin, la coalescence d’un échantillon formulé dans le PBS intervient au bout de 6h environ,

sa précipitation complète a lieu sous 24h. Comme nous l’avions envisagé, les effets de sels induisent une déstabilisation plus rapide des édifices supramoléculaires de TriCat12 formulés dans le tampon PBS par rapport à une formulation dans l’eau, ce qui présente un inconvénient pour leur utilisation à des fins d’application cellulaire. Ce protocole doit donc être optimisé.

3.2.3.2. Stabilité à la dilution des vésicules

3.2.3.2.1. Stabilité à la dilution dans le milieu de formulation

Dans le but d’améliorer la stabilité dans le temps des vésicules catanioniques, nous avons exploré par diffusion dynamique de la lumière le devenir de ces agrégats supramoléculaires lors de leur dilution dans leur milieu de formulation (cf Figure II- 12).

Figure II- 12 : Diamètres hydrodynamiques moyens d’agrégats de TriCat12 préparés et dilués en série (R=2) respectivement dans : (bleu) de l’eau, (rouge) du tampon PBS, (jaune) du tampon P.

Les résultats présentés sont représentatifs des valeurs obtenues sur trois échantillons indépendants.

La Figure II- 12 présente les variations de diamètres de ces vésicules au cours de dilutions successives dans leur milieu de formulation. Nous observons le maintien des diamètres vésiculaires aux alentours de 200 à 250nm dans l’eau ainsi que dans le tampon P, bien que la concentration finale soit inférieure à la CAC du TriCat12. Il en est de même pour les vésicules formulées et diluées dans le tampon PBS, où leur diamètre est conservé autour de 400 à 500 nm au cours des dilutions successives. Ces résultats attestent donc d’une stabilité des vésicules à la dilution. Ce paramètre pourra s’avérer pertinent lors d’applications en biologie. Il est à présent intéressant d’étudier la cinétique de réarrangement des tensioactifs catanioniques après leur dilution. Pour cela, la taille d’un échantillon de vésicules de

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TriCat12 formulées dans l’eau a été suivie dans le temps après sa dilution dans l’eau. Les résultats sont reportés sur la Figure II- 13.

Figure II- 13 : Stabilité dans le temps d’un échantillon de vésicules de TriCat12 formulé à 1 x 10-4M dans l’eau, puis dilué à 2 x 10-5M dans l’eau.

La zone blanche (A) correspond à un échantillon transparent, homogène et bleuté. La zone gris clair (B) correspond à l’apparition d’un léger trouble dans l’échantillon, la zone gris foncé correspondant à la précipitation de l’échantillon (C) n’a pas encore été observée.

La taille des vésicules est maintenue aux alentours de 200nm pendant environ trois mois, la solution demeurant transparente, homogène et bleutée. Ensuite, un léger trouble est observé dans la solution, s’accompagnant d’un grossissement des vésicules vers 320nm. Après plus de huit mois, aucune précipitation de l’échantillon n’a encore été observée. La comparaison de ces valeurs avec la stabilité de l’échantillon non dilué (cf Figure II- 11) traduit un renforcement de la stabilité des vésicules en solution, dont le diamètre est stabilisé à 200nm pendant une échelle de temps neuf fois plus importante. Ceci s’explique par le fait que la dilution a permis d’éloigner spatialement les vésicules catanioniques les unes des autres, limitant considérablement leur rencontre et donc leur coalescence.

Au vu de ces résultats, il semblerait que la cohésion des agrégats de TriCat12 soit suffisamment importante pour les maintenir à l’état vésiculaire sur une large échelle de temps, la cinétique de réarrangement des tensioactifs entre les phases libre et agrégée est donc probablement longue. Afin de vérifier cette hypothèse, une expérience de tensiométrie a été mise en œuvre (cf Figure II- 14).

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Figure II- 14 : Variation dans le temps de la tension de surface d’un échantillon de vésicules de TriCat12 formulé à 1 x 10-4M dans l’eau, puis dilué à 2 x 10-5M dans l’eau (t=0).

L’encart rappelle la détermination de la CAC du TriCat12 dans l’eau (cf Figure II- 7).

Un échantillon de vésicules de TriCat12 formulées dans l’eau à une concentration supérieure à la CAC a une tension de surface de 30 mN/m. Après dilution en dessous de la CAC, si les vésicules n’étaient pas stables à la dilution, leur dégradation entraînerait une augmentation immédiate de la quantité de tensioactifs libres en solution. La tension de surface de l’échantillon devrait alors correspondre à celle d’une solution de tensioactifs libres à cette concentration (soit 47mN/m à 2 x 10-5M).

Cependant, la tension de surface est restée stable autour de 62 mN/m pendant environ trois mois. Cette valeur correspond à la tension de surface des tensioactifs libres de la solution mère après leur dilution par le facteur de dilution appliqué sur les vésicules. Ceci traduit le fait que la quantité de tensioactifs libres en solution n’a pas augmenté lors de la dilution, le tensioactif TriCat12 est donc resté sous forme d’agrégat vésiculaire après dilution, et ce pendant une durée d’environ 90 jours. Ces résultats sont en accord avec les mesures de DDL (cf Figure II- 8).

Par ailleurs, nous observons à partir du quatrième mois une décroissance lente de la tension de surface de l’échantillon, traduisant une libération progressive de tensioactifs libres en solution ou résultant d’une dégradation enzymatique.

L’équilibre thermodynamique entre les vésicules et les tensioactifs libres n’est pas encore établi après plus de huit mois, en effet les structures vésiculaires n’ont pas encore fini de se dégrader pour libérer des tensioactifs libres. Cet équilibre, qui sera atteint lorsque la tension de surface aura diminué jusqu’à la valeur de 50 mN/m, possède donc une cinétique particulièrement longue.

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En conclusion, cette étude de stabilité a montré que les vésicules catanioniques sont préparées de façon optimale lorsque le solvant de formulation est faiblement ionisé, comme l’eau ou le tampon P. Une formulation dans le tampon PBS ne permet pas d’obtenir des vésicules avec une stabilité satisfaisante pour envisager des applications biologiques. Il est donc écarté des protocoles de formulation envisageables. De plus, la dilution des vésicules leur confère une stabilité optimale, notamment lorsqu’elles sont formulées dans l’eau. Cette constatation constitue le point de départ de l’optimisation du protocole de préparation des vésicules catanioniques pour des applications de vectorisation.

3.2.3.2.2. Stabilité à la dilution en milieu physiologique

Ces vésicules étant destinées à vectoriser des principes actifs sur cellules, nous avons étudié leur devenir en milieu physiologique. Du point de vue de la biologie cellulaire, l’ordre de grandeur des concentrations en nanovecteurs appliqués est inférieur à celles que nous avons utilisées dans le cadre d’une caractérisation physico-chimique, généralement de l’ordre d’une à deux dizaines de micromolaires [361-363]. Ces valeurs étant inférieures à la CAC du TriCat12, il est nécessaire de formuler les vésicules dans une concentration au dessus de leur CAC et de les diluer ultérieurement, puisque celles-ci présentent une stabilité à la dilution. La stabilité des vésicules étant optimale lorsqu’elles sont formulées dans l’eau, nous avons choisi ce solvant de formulation, en envisageant de les diluer ensuite dans d’autres milieux permettant la survie biologique. Cependant, cette démarche soulève plusieurs problématiques, notamment au niveau de la conservation de l’intégrité des vésicules aux contraintes de pH, de force ionique et de pression osmotique inhérentes à un tel protocole de formulation.

C’est pourquoi, dans un premier temps, il a été nécessaire de vérifier que la dilution dans l’eau ultrapure du tampon PBS et des milieux DMEM, EMEM et RPMI induit des variations de pH et de force ionique négligeables. Cependant, la force ionique d’une solution de composition ionique variée et inconnue est difficilement mesurable. En première approximation, on peut corréler cette grandeur à la conductivité électrique de la solution. C’est pourquoi la conductivité électrique et le pH de ces solutions ont été mesurés (cf Tableau II- 3).

Milieux purs Milieux dilués dans H2O

Milieu Conductivité (mS/cm) pH (-) Milieu Conductivité (mS/cm) pH (-) H2O 1,7 x 10-3 6,12 / / / Tampon PBS 14,86 7,50 Tampon PBS/H2O (80 : 20) 12,50 7,53 DMEM 13,11 7,64 DMEM/H2O (80 : 20) 10,64 7,65 EMEM 13,38 8,15 EMEM/H2O (80 : 20) 11,11 8,03 RPMI 13,37 7,40 RPMI/H2O (80 : 20) 11,13 7,52 NaCl 0,15M 14,80 7,70 NaCl 0,15M/H2O (80 : 20) 12,05 7,35

Tableau II- 3 : Valeurs de conductivité électrique et de pH du tampon PBS et des milieux de culture DMEM, EMEM et RPMI purs et dilués avec 20% d’eau ultrapure.

Les valeurs de l’eau ultrapure et d’une solution référence de NaCl de force ionique 0,15M pure et diluée sont données à titre indicatif.

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