55 endosomes tardifs (pH≈5) [142] avant de fusionner avec les lysosomes [143] , organelles

cellulaires de 0,1 à 1,2µm de diamètre qui génèrent un environnement hostile riche en enzymes hydrolytiques afin de digérer le contenu internalisé [95].

Endocytose en phase fluide. L’endocytose en phase fuide est un mécanisme de pinocytose non spécifique qui intervient généralement durant le processus d’endocytose par voie des clathrines. Par ce mécanisme, le fluide extracellulaire est endocyté et absorbé par les cellules à l’intérieur des vésicules de clathrines, sans être directement relié à la membrane plasmique. Dans ce cas, la cinétique de transport à travers la voie endolysosomale est considérablement ralentie par rapport à l’endocytose récepteur-dépendante [144].

3.1.2.1.2. Intérêt de la stimulation de l’endocytose par voie des clathrines

En général, l’internalisation de systèmes de délivrance de principes actifs par voie des clathrines est intentionnellement évitée pour se soustraire aux inconvénients d’une dégradation lysosomale. Cependant, des études récentes ont montré l’utilité clinique d’un adressage de protéines par voie des clathrines, dans l’intention de traiter certains cancers

[145]_{, la maladie d’Alzheimer} [146]_{, ainsi que des maladies inhérentes au stockage lysosomal} [95]_{. Suivant le compartiment subcellulaire visé, il peut donc être tout à fait pertinent}

d’employer la voie des clathrines pour internaliser les vecteurs [147]. 3.1.2.1.3. Stratégies de stimulation de l’endocytose par voie des clathrines

Taille des particules. La taille des particules et leur distribution de taille sont des paramètres physico-chimiques importants régulant la stabilité des nanoparticules, ainsi que la teneur en principe actif vectorisé. Ces paramètres déterminent la pharmacodynamique de ce dernier, puisqu’ils influencent la biodistribution des nanoparticules [148]. De plus, après avoir évité l’opsonisation et la phagocytose, ils influencent la capacité de ciblage cellulaire des vecteurs et leur entrée dans les cellules, ainsi que le relargage du principe actif.

Desai et al. [149] ont notamment montré l’influence de la taille des particules sur l’endocytose par voie des clathrines. Ils ont étudié l’internalisation par les cellules Caco-2 (adénocarcinomes d’épithélium colorectal humain) de particules polymériques de diamètre variant de 100nm à 1µm. Leurs observations montrent que seules les particules de 100nm de diamètre ont été endocytées par la voie des clathrines.

Rejman et al. [150] ont obtenu une dépendance similaire de la taille de particules sur la voie des clathrines lors d’une étude d’internalisation de microsphères de diamètres variant de 50nm à 1µm par des mélanomes murins B16. Ils ont montré que la taille maximale des particules internalisées par voie des clathrines est de 200nm. Au-delà de cette valeur, ils ont mis en évidence l’intervention de voies indépendantes des clathrines. De plus, leur étude sur l’endocytose par voie des clathrines a révélé que des particules de 50nm de diamètre sont internalisées plus rapidement que des particules de 200nm. Ce phénomène cinétique a aussi été observé sur des particules virales [151], ou encore des polyplexes [152].

Charge et morphologie des particules. La taille n’est pas le seul paramètre physico-chimique à prendre en compte lors de la conception de particules destinées à être internalisées par la voie des clathrines : leur charge joue aussi un rôle important.

En effet, la membrane plasmique étant chargée négativement, des nanovecteurs chargés positivement ont une plus grande affinité pour les cellules, entraînant une internalisation plus importante.

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Dans une étude récente, Wang et al. [153] ont remarqué que des liposomes de phosphatidylcholine et cholestérol chargés négativement n’ont pas réussi à relarguer leur drogue (de la calcéine) dans des cellules MCF-7 (adénocarcinome de sein humain), alors que des liposomes analogues chargés positivement ont montré un taux de relargage significativement amélioré.

Harush-Frenkel et al. [154] ont confirmé cette influence de la charge des particules en formulant des nanosystèmes matriciels de D,L-poly(lactide) chargés positivement ou négativement, et en étudiant leur taux d’internalisation par des cellules HeLa (carcinomes d’épithélium humain). Afin d’identifier clairement le mécanisme d’endocytose, ils ont inhibé la voie des clathrines en utilisant un mutant de la dynamine qui inhibe l’événement de scission des vésicules d’invagination. Cette espèce bloque aussi une autre voie importante d’endocytose, qui utilise les cavéoles (cf paragraphe 3.1.2.2.1). Les nanoparticules chargées positivement ont montré un taux et une vitesse d’internalisation largement supérieurs aux nanoparticules chargées négativement. Ces deux types de particules n’ont pas utilisé le même mode d’entrée dans les cellules : les particules positives ont eu recours à l’endocytose par voie des clathrines, alors que les négatives ont emprunté une voie indépendante des clathrines et des cavéoles.

Dans une étude plus récente, cette équipe a montré [155] que la charge de surface des nanoparticules a aussi une grande influence sur leur mode d’entrée à travers la membrane apicale de cellules polarisées, les MDCK (cellules d’épithélium canin). Dans ce cas aussi, les particules cationiques ont été préférentiellement endocytées par la voie des clathrines dans la zone membranaire apicale, bien que la différence observée avec des particules anioniques ait été moins importante, probablement à cause de la faible activité d’endocytose par voie des clathrines de la surface apicale des cellules MDCK [156].

De plus, l’influence de la charge de nanoparticules a été largement étudiée sur les complexes d’ADN avec des lipides ou des polymères cationiques (respectivement lipoplexes et polyplexes). Ces systèmes de délivrance de principes actifs utilisés pour la transfection d’ADN sont connus pour entrer dans les cellules grâce au processus d’endocytose par voie des clathrines [37, 39, 157, 158].

Par ailleurs, la charge des particules a une grande influence sur l’endocytose par voie des clathrines, et ce quelle que soit leur morphologie. Gratton et al. [159] ont conçu des particules cylindriques monodisperses, de diamètre 1µm, chargées positivement ou négativement. Là encore, les particules positives ont été préférentiellement endocytées par rapport aux négatives, par différents types cellulaires (HeLa, NIH3T3 –fibroblastes murins-, OVCAR-3 – carcinomes d’ovaires humains-, et MCF-7).

En contre-partie, des particules positivement chargées peuvent avoir des effets cytotoxiques, dans la mesure où leurs affinités électrostatiques pour les phospholipides de la membrane cellulaire peuvent entraîner une déterioration, voire une rupture, de celle-ci [160,

161]

. A l’inverse, la présence de charges légèrement négatives à la surface des nanoparticules permet de réduire la clairance indésirable par le système réticulo-endothélial et d’améliorer la compatibilité sanguine. Une récente étude a montré que de telles particules délivrent de façon plus efficace des principes actifs anti-cancéreux à des cellules tumorales [162].

Surface des particules. Pour favoriser l’endocytose par la voie des clathrines, la stratégie de greffage de ligands à la surface des particules s’est largement développée. Ces ligands se

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