135 niveau de leur synthèse, qui peut être complexe et coûteuse du fait de l’utilisation de ligands

biologiques, mais aussi au niveau de leurs propriétés pharmacocinétiques, puisque les principes actifs doivent être clivés de leur module d’adressage pour interagir avec les cellules cibles. Une alternative intéressante consiste donc à utiliser des photosensibilisateurs de deuxième génération et à les adresser par un ciblage passif, en utilisant des vecteurs qui peuvent les encapsuler, les transporter puis les relarguer de façon sûre, spécifique et rapide.

1.2.

Vectorisation et PDT

La présence de structures macrocycliques rend ces molécules photosensibilisatrices difficiles à administrer directement, en raison de leur forte hydrophobie. Afin d’y remédier, diverses formulations ont vu le jour pour l’encapsulation et la vectorisation de ces principes actifs. Plusieurs classifications des nanoparticules utilisées en PDT ont été reportées [403], suivant leur composition (naturelle ou synthétique ; organique ou inorganique), suivant leur morphologie (sphère, tube, etc), ou encore suivant leur structure (oxyde, métaux, sels, polymères, etc).

La PDT reposant sur l’efficacité de production d’oxygène singulet et sa diffusion dans le cytoplasme cellulaire, une classification récente s’est intéressée à la stratégie de conception des nanoparticules [8].

 D’une part, on répertorie les nanoparticules biodégradables qui libèrent l’agent photosensibilisateur au sein du cytoplasme cellulaire une fois la barrière membranaire passée, une irradiation subséquente permet leur excitation pour produire l’oxygène singulet.

 D’autre part, la PDT peut utiliser des nanoparticules non-biodégradables, qui, une fois internalisées par les cellules, restent intègres dans le cytoplasme et laissent pénétrer en leur cœur l’oxygène triplet grâce à une structure poreuse. Après excitation de ce dernier au contact de la molécule photosensibilisatrice piégée dans leur cœur, ces nanoparticules laissent s’échapper l’oxygène singulet qui retourne vers le cytoplasme. Une alternative consiste à greffer de façon covalente les molécules photosensibilisatrices en périphérie des nanoparticules, pour un accès plus direct [404].

Les nanoparticules biodégradables, de composition organique, sont la plupart du temps de nature polymérique (comme des particules de polyesters aliphatiques) ou lipidique (liposomes, par exemple) [405]. Biocompatibles, elles possèdent par ailleurs l’avantage d’un fort rendement d’encapsulation, la possibilité de contrôler le relargage ou encore l’existence d’une large variété de matériaux et de procédés de fabrication [406]. Cependant, cette biodégradabilité peut constituer un frein à leur développement, particulièrement du point de vue cinétique, puisque leur dégradation au sein des cellules et donc le relargage de la drogue ne sont pas immédiats, mais aussi d’un point de vue du respect de l’intégrité du principe actif qui risque d’être dégradé par l’activité métabolique cellulaire.

Les particules non-biodégradables, quant à elles, permettent d’outrepasser ces inconvénients. Elles sont la plupart du temps constituées de céramique (silice inerte, notamment) ou de métaux (par exemple l’or) [8]. Elles possèdent l’avantage d’être particulièrement stables aux fluctuations de température et de pH [407]. Leur taille, morphologie, porosité et monodispersité sont facilement contrôlables lors de leur préparation [408]. Elles sont de plus particulièrement résistantes aux attaques microbiennes

136

[409]

. En revanche, leur inertie et leur stabilité peuvent poser des problèmes pour leur élimination.

A cette classification de vecteurs « passifs », Chatterjee et al. [405] ont récemment opposé des nanoparticules de seconde génération, dites « actives » puisqu’elles possèdent directement des propriétés photosensibilisatrices, comme les quantum dots ou les nanoparticules auto- luminescentes. Cependant, là encore, des problèmes de toxicité et d’élimination peuvent apparaître.

Ainsi, si la stratégie de vectorisation semble pertinente pour améliorer l’efficacité de traitement anticancéreux par PDT, le développement du vecteur optimal est loin d’être résolu.

1.3.

Objectif de l’étude

La conception de systèmes permettant l’encapsulation de photosensibilisateurs avec un fort rendement constitue un véritable défi scientifique. Dans l’idéal, ces systèmes seraient composés de matériaux biodégradables et biocompatibles, faciles à éliminer par le corps humain. Le respect de leur intégrité après leur internalisation dans les cellules assurerait une excellente protection des molécules photosensibilisatrices tout en leur permettant d’activer l’oxygène pour induire la mort cellulaire.

Comme nous l’avons vu précédemment, les vésicules catanioniques constituent une alternative aux autres systèmes de délivrance de principes actifs, qui assurent protection et adressage intracellulaire de molécules d’hydrophobie variée. Leur structure biocompatible et leur stabilité en font des candidats de choix pour l’encapsulation de molécules photosensibilisatrices dans le cadre d’une PDT anticancéreuse.

L’objectif de cette étude est donc d’étudier la faisabilité d’une telle encapsulation pour améliorer le profil pharmacocinétique du principe actif tout en assurant son activité photosensibilisatrice.

Dans un premier temps, la formulation de vecteurs colloïdaux catanioniques a été mise au point. Ensuite, nous avons étudié le comportement photocytotoxique de tels systèmes sur des cellules de cancer de la peau et des muqueuses cultivées in vitro, en vérifiant le respect de l’activité photoexcitatrice de l’oxygène une fois les systèmes internalisés par les cellules.

137

2. Mise au point de vésicules catanioniques contenant des

phthalocyanines de chloroaluminium (ClAlPc)

2.1.

ClAlPc : caractéristiques et applications pour la PDT

Les phthalocyanines constituent une large classe de composés avec un coefficient d’extinction élevé dans la région spectrale de 630 à 800nm. Plusieurs études ont montré leur efficacité pour induire une mort cellulaire dans le cadre d’un traitement par PDT, in vitro [410,

411] _{comme in vivo} [412, 413]_{. Elles présentent l’avantage d’être des composés chimiquement}

purs et identifiés, à l’inverse des dérivés hématoporphyrines largement utilisés en mélange pour la PDT. De plus, les phthalocyanines absorbent la lumière à une longueur d’onde plus importante que la plupart des autres familles de photosensibilisateurs (notamment les hématoporphyrines), cette lumière pénètre donc plus profondément dans les tissus [414]. En particulier, les phthalocyanines de chloroaluminium (ClAlPc) (cf Figure IV- 3) répondent aux spécifications photophysiques et photochimiques leur permettant d’assurer le rôle de photosensibilisateurs dans le cadre d’une PDT [415].

Figure IV- 3 : Structure de la phthalocyanine de chloroaluminium (ClAlPc).

En environnement hydrophobe, les ClAlPc sont présentes à l’état monomérique [415, 416]. Un maximum d’absorption est observé à la longueur d’onde de 670nm (cf Figure IV- 4 (A)), tandis que le maximum d’émission de fluorescence, variable suivant le milieu, est relevé à vers 670nm-680nm (cf Figure IV- 4 (B)).

En revanche, comme la plupart des phthalocyanines, les ClAlPc sont agrégées en milieu aqueux, même à faible concentration. Etant donnée leur absence de solubilité dans l’eau, il est impossible de déterminer la constante de dissociation des agrégats [415]. La formation d’agrégats en milieu aqueux se traduit par une extinction des propriétés spectroscopiques de ClAlPc, d’absorption UV-Visible (cf Figure IV- 4 (A)) comme d’émission de fluorescence (cf Figure IV- 4 (B)).

138

Figure IV- 4 : (A) Spectre d’absorption UV-Visible et (B) spectre d’intensité de fluorescence (ex: 610nm) de

ClAlPc libre dans un environnement hydrophile (DMSO/H2O (1 : 50), trait noir continu) et dans un

environnement hydrophobe (DMSO/acétonitrile (1 : 50), trait gris pointillé).

Ces molécules possèdent une efficacité accrue pour la destruction de tumeurs solides in

vivo, par comparaison avec des dérivés sulphonés de ClAlPc hydrophiles, pourtant très

prometteurs en PDT clinique. En effet, une étude [413] a montré que ClAlPc a un mode d’action antitumorale prolongé jusqu’à 24h post-irradiation, suite à une cytotoxicité directe mais aussi à des dommages de la vascularisation tumorale. Grâce à cette double action, ClAlPc ouvre de larges perspectives dans la stratégie de thérapie anticancéreuse.

Cependant, le principal frein à leur utilisation concerne leur faible biocompatibilité, dans la mesure où leur hydrophobie limite une bonne biodistribution dans les milieux biologiques. Afin d’outrepasser cet inconvénient, la stratégie d’encapsulation (liposomes, nanocapsules, nanoémulsions) a été envisagée [381, 417, 418] pour protéger le principe actif, et ainsi empêcher ses problèmes d’insolubilité, réduire ses effets secondaires systémiques tout en les vectorisant à l’intérieur des cellules. Les résultats obtenus in vitro ont prouvé l’efficacité photosensibilisatrice de ClAlPc administré par formulation liposomale [419, 420].

Dans la continuité de telles recherches, nous avons expérimenté l’insertion des ClAlPc au sein des vésicules catanioniques.

2.2.

Insertion des ClAlPc au sein de la bicouche des vésicules

catanioniques

2.2.1. Mise au point de vésicules de TriCat12/ClAlPc

Afin d’insérer la molécule hydrophobe dans les bicouches catanioniques des vésicules du tensioactif TriCat12 sans perturber l’agrégation de ce dernier, plusieurs protocoles de formulation ont été envisagés.

La méthode dite « du film », couramment utilisée pour l’encapsulation de molécules dans les bicouches des liposomes, a été adaptée aux vésicules de TriCat12. Outre une mise en place longue, fastidieuse et consommant abondamment des solvants organiques (méthanol et chloroforme), cette méthode s’est révélée inadaptée car les vésicules ainsi formées ont précipité dans l’heure ayant suivi leur formation. Ce protocole a donc été abandonné.

139