181 (500µM), en présence ou non de vésicules catanioniques encapsulant le Texas Red.

L’échantillon ne comprenant pas de vésicules catanioniques permet de déterminer le minimum d’intensité de fluorescence du au bruit extérieur.

2.2.

Interaction entre les vésicules catanioniques et des cellules

cultivées in vitro

2.2.1. Matériels commerciaux utilisés

Le Sérum de Veau Fœtal provient de Lonza® (Bâle, Suisse). Le tampon PBS, la L-glutamine et la pénicilline sont fournis par Eurobio® (Courtaboeuf, France). Les vitamines, le tryptose phosphate et le glucose sont achetés chez Sigma-Aldrich Chemical Co® (St. Louis, MO, USA). Les plaques 24 puits sont fournies par Nunc / Thermo Fischer Scientific® (Waltham, MA, USA). Les tubes de cytométrie en flux proviennent de BD Biosciences® (Franklin Lakes, NJ, USA). Les autres consommables plastiques de laboratoire utilisés pour la culture cellulaire proviennent de Dutscher SAS® (Brumath, France).

Les cellules CHO-Z proviennent d’un clone sélectionné pour pousser en suspension.

2.2.2. Vésicules catanioniques utilisées

Afin d’étudier leur comportement d’interaction avec les cellules, les vésicules catanioniques de composition suivante sont préparées : TriCat12/FluoCat, TriCat12/Texas Red et TriCat12/FluoCat/Texas Red. Elles sont formulées dans l’eau et diluées dans le milieu de culture EMEM sans sérum de veau fœtal jusqu’à 2 x 10-5M selon les protocoles décrits précédemment.

2.2.3. Culture cellulaire

Les cellules d’Ovaires de Hamster Chinois (CHO) ont été cultivées de façon adhérente à 2 x 105 cell/mL dans du EMEM supplémenté avec 10% (v/v) de sérum de veau fœtal (SVF), 1% (v/v) de L-glutamine (2mM), 1% (v/v) de pénicilline streptomycine (50 IU/mL), 1% (v/v) de glucose, 1% (v/v) de vitamines and 1% (v/v) de tryptose phosphate. Elles ont été cultivées dans un incubateur à 37°C, 5% de CO2, en atmosphère à 80% d’humidité et dans des

conditions d’obscurité. Les cellules ont été repiquées tous les 2 jours.

2.2.4. Etude de cytotoxicité des vésicules catanioniques sur CHO

La cytotolérance aigue des cellules en présence d’échantillons variés de vésicules catanioniques à différentes concentrations a été déterminée en utilisant un kit de test de prolifération cellulaire au 2,3-bis[2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl]-2H-tétrazolium-5- arboxanilide (XTT). Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à 2 x 105 cellules/mL et incubées pendant 48h. Les cellules ont été lavées 3 fois avec un tampon PBS puis incubées pendant 3h avec les différentes solutions de vésicules catanioniques (TriCat12, TriCat12/FluoCat, TriCat12/Texas Red, TriCat12/FluoCat/Texas Red) de concentration en TriCat12 variant de 1 x 10-4M à 2 x 10-7M obtenues par dilutions sériées (R=2) dans le milieu EMEM sans sérum. Ensuite, les cellules ont été lavées au PBS et mises dans 50µL d’une solution d’EMEM sans Rouge Phénol contenant le XTT (0,5 mg/mL) et la coenzyme Q (40µL/mL). Après 3h d’incubation, 100µL d’une solution à 10% de dodécylsulphate de sodium (SDS) ont été ajoutés. Les résultats ont été lus sur un spectrophotomètre Polarstar Galaxy (BMG Labtech, France) à la longueur d’onde de 450nm.

182

Un optimum de viabilité des CHO (près de 100%) est observé après 3h d’incubation avec les vésicules diluées à 2 x 10-5M en TriCat12, quelle que soit la composition des vésicules (TriCat12, TriCat12/FluoCat (95:5), TriCat12 formulé dans une solution aqueuse de Texas Red (500µM), TriCat12/FluoCat (95:5) formulé dans une solution aqueuse de Texas Red (500µM)). C’est pourquoi dans la suite de l’étude, les vésicules catanioniques sont formulées à 1 x 10-4M puis diluées dans le milieu de culture jusqu’à 2 x 10-5M. La stabilité à la dilution des vésicules a été vérifiée par DLS et tensiométrie.

2.2.5. Inhibition de l’internalisation par endocytose

Pour étudier le phénomène d’endocytose, des agents inhibiteurs d’endocytose couramment décrits dans la littérature [208] ont été appliqués sur les cellules CHO : A, amiloride; C, chlorpromazine; F, filipine. La concentration optimale de chaque inhibiteur a été déterminée par une étude préliminaire où une gamme de concentrations dans le milieu de culture a été appliquée sur les cellules. Les concentrations choisies ont montré une efficacité d’inhibition maximale tout en restant non cytotoxiques : (A) : 1mg/mL; (C) : 1.3 x 10-2mg/mL; (F) : 1.5 x 10-3mg/mL; et (ACF) : le mélange des 3 agents inhibiteurs à des concentrations identiques à celle de chaque agent utilisé seul. Les cellules CHO ont été pré-traitées avec ces agents pendant 1h dans un incubateur (37°C, 5% CO2) avant l’introduction des vésicules

catanioniques, qui ont été incubées dans des conditions identiques en maintenant la présence des agents d’inhibition aux mêmes concentrations (pendant 1h dans le cas de l’expérience en cytométrie de flux et 15 min dans le cas de l’étude en microscopie confocale).

Dans le cas de l’inhibition de tous les processus actifs par température froide, les cellules CHO ont été incubées à 4°C dans l’obscurité 15 min avant d’introduire les vésicules catanioniques. Ces dernières ont été ajoutées tout en maintenant cette température tout au long de l’expérience d’interaction vésicule/cellule.

2.2.6. Observation par microscopie confocale

L’évaluation de l’interaction entre les cellules et les vésicules a été réalisée par microscopie confocale. Les cellules CHO ont été ensemencées à 8 x 104 cellules/mL sur des lamelles compartimentées 2 puits Lab-TekTM (Nunc, Dutscher) 24h à l’avance. Ensuite, les cellules ont été lavées 3 fois au PBS. Elles ont été incubées pendant 15 min avec les vésicules catanioniques préalablement diluées à 2 x 10-5 M dans du milieu EMEM sans sérum. Ensuite, les cellules ont été lavées avec du PBS froid puis observées en microscopie confocale dans du PBS renouvelé. L’imagerie cellulaire a été réalisée sur cellule vivante à l’aide d’un microscope biphoton Zeiss® LSM 710 Inv (obj. x 40 à eau), en utilisant un laser Argon à 488nm et un laser DPSS à 561nm pour exciter le FluoCat et le Texas Red, respectivement. Trois clichés de chaque condition contenant jusqu’à 20 cellules par cliché ont été observées avec le logiciel ImageJ® sans aucune quantification. Les images sont représentatives des données originales.

2.2.7. Quantification par cytométrie en flux (CMF)

Les cellules CHO ont été ensemencées sur des plaques 24 puits à 7,5 x 104 cellules/mL 24h à l’avance dans du milieu EMEM supplémenté comme précédemment. Les cellules ont été lavées 3 fois au PBS. Elles ont été incubées pendant 1h avec les vésicules catanioniques préalablement diluées à 2 x 10-5 M dans du milieu EMEM sans sérum. Ensuite, elles ont été

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