INCORPORATION DE SONDES FLUORESCENTES AU SEIN DES VESICULES CATANIONIQUES

4.1. INSERTION D’UNE SONDE AMPHIPHILE, LE « FLUOCAT » 99

4.1.1. Insertion de la sonde 99

4.1.2. Stabilité à la dilution des vésicules de TriCat12/FluoCat 101

4.1.2.1.Stabilité à la dilution dans le milieu de formulation 101

4.1.2.2.Stabilité à la dilution en milieu physiologique 101

4.2. ENCAPSULATION D’UNE SONDE HYDROPHILE, LE TEXAS RED 102

4.2.1. Choix de la sonde hydrophile 102

4.2.2. Encapsulation de la sonde Texas Red 103

4.2.3. Stabilité à la dilution des vésicules de TriCat12/Texas Red 104

4.2.3.1.Stabilité à la dilution dans le milieu de formulation 104

4.2.3.2.Stabilité à la dilution en milieu physiologique 105

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1. Introduction

Comme nous l’avons vu dans le chapitre de mise au point bibliographique, les liposomes constituent un système performant et couramment utilisé pour l’encapsulation et la vectorisation de drogues thérapeutiques. Cependant, leur mode de préparation complexe, qui nécessite d’être adapté au principe actif à vectoriser, limite souvent leur utilisation. Leur instabilité constitue aussi un inconvénient majeur : en effet, selon la théorie d’Israelachvili[331], l’assemblage de phospholipides correspondant à leur état d’équilibre est sous la forme d’une bicouche lipidique plane. Pour obtenir une organisation vésiculaire, un apport d’énergie est nécessaire ; c’est pourquoi le procédé de formulation de liposomes fait couramment intervenir une étape d’extrusion. Cette mise en œuvre est donc complexe et onéreuse, ce qui constitue un frein à leur développement industriel.

La synthèse de systèmes vésiculaires stables thermodynamiquement constitue un véritable défi scientifique. Des travaux préliminaires à ce projet [55, 330] ont permis d’envisager la mise en œuvre de vésicules unilamellaires mimant les systèmes liposomaux, tout en possédant l’avantage d’une préparation simple par auto-assemblage spontané de tensioactifs dits « catanioniques », c’est-à-dire stabilisés par la présence simultanée d’amphiphiles ioniques de charges opposées. Les vésicules catanioniques possèdent la même capacité à vectoriser des substances que les liposomes. Elles assurent tout aussi bien la protection des drogues encapsulées, réduit leur toxicité et améliore leur durée d’efficacité. La simplicité de leur mode de préparation, leur stabilité et leurs propriétés de dispersion en phase aqueuse en font des assemblables moléculaires de choix dans la mise en œuvre de systèmes de vectorisation.

Dans un souci de respect des principes fondamentaux de la Chimie Verte, un procédé de mise au point de tensioactifs à base de sucre a été développé. Provenant de matériaux renouvelables, ces tensioactifs sont biocompatibles et non toxiques [332]. De plus, ils sont considérablement moins chers et beaucoup plus faciles d’utilisation que des phospholipides. Des études préliminaires menées au laboratoire [55, 56] se sont intéressées à l’influence de divers paramètres physico-chimiques pour l’obtention de vésicules catanioniques stables, de forme sphérique et capables d’encapsuler des principes actifs. A présent, l’objectif de cette partie est d’améliorer le design de vésicules catanioniques en optimisant leurs propriétés physico-chimiques et de mettre au point un protocole de formulation de façon à pouvoir, ultérieurement, étudier avec précision le mécanisme de vectorisation et de délivrance de principes actifs vers des cellules cibles.

Afin d’atteindre cet objectif, la première étape a concerné la mise au point de la structure optimale du tensioactif tricaténaire catanionique pour la formation de vésicules. Ensuite, les propriétés physico-chimiques des vésicules catanioniques ont été caractérisées dans différents milieux. La compréhension des mécanismes d’auto-assemblage a permis de mettre au point un protocole de formulation de vésicules applicable en milieu physiologique. Des tests d’encapsulation de molécules fluorescentes de différentes hydrophilies ont finalement été réalisés.

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2. Conception d’un tensioactif tricaténaire catanionique, le

« TriCat12 »

Les tensioactifs catanioniques constituent les briques élémentaires de la structure des vésicules catanioniques. La conception d’un tensioactif catanionique particulier, le « TriCat12 », a été optimisée dans la perspective de formuler des vésicules utilisables en vectorisation.

2.1.

Généralités sur la conception de tensioactifs catanioniques

Les tensioactifs catanioniques sont des molécules amphiphiles constituées de deux tensioactifs de charges opposées, associés par des interactions électrostatiques et des forces de Van des Waals. La plupart du temps, ces structures sont bicaténaires (cf Figure II- 1).

Figure II- 1 : Représentation schématique d’un tensioactif catanionique bicaténaire.

Les mélanges de tensioactifs chargés qui libèrent leurs contre-ions en solution lors de leur association sont à distinguer des paires d’ions amphiphiles où les contre-ions sont éliminés, voire inexistants [333]. Dans ce dernier cas uniquement, on parle de tensioactifs catanioniques. Ce dernier mode de préparation est plus pertinent pour envisager une étude physico-chimique, dans la mesure où les contre-ions pourraient complexifier considérablement le système.

Il existe quatre voies de synthèse de paires d’ions pures actuellement décrites dans la littérature [334-336]. Les trois premières éliminent les sels résiduels par des méthodes d’extraction par solvant organique, par précipitation ou par échange d’ions.

La dernière méthode, mise au point au laboratoire [337, 338], fait intervenir un échange de protons entre deux tensioactifs précurseurs, l’un porteur d’un groupement acide et l’autre d’un groupement amine. La réaction acido-basique permet l’ionisation mutuelle des deux espèces et leur association catanionique en l’absence de contre-ions. Cette méthode d’éco- conception de tensioactifs catanioniques s’inscrit dans une démarche de synthèse verte, dans la mesure où la réaction, intervenant dans l’eau, est spontanée et ne nécessite ni solvants organiques ni méthodes physiques consommatrices d’énergie pour la purification des paires d’ions. Cette stratégie a été exploitée industriellement dans le cadre d’applications thérapeutiques, où l’un des deux tensioactifs est un principe actif [339, 340]. Ce dernier participe donc à sa propre vectorisation, on parle alors de « formulation bioactive ».

La structure des tensioactifs catanioniques est facilement modulable suivant le besoin. Afin de faciliter leur solubilisation dans l’eau, l’utilisation d’amphiphiles glycosidiques à forte hydrophilie a été développée [329, 341, 342]. Cette tête sucre présente des avantages de

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biocompatibilité notamment exploités dans la conception d’analogues du galactosylcéramide dans le cadre d’une thérapie anti-VIH [337, 343].

Par ailleurs, afin de renforcer l’effet hydrophobe qui constitue le principal moteur d’association des tensioactifs en vésicules, une troisième chaîne lipidique a été ajoutée, donnant naissance à un tensioactif tricaténaire[344, 345]. Dans cet objectif, un acide à double chaîne aliphatique a été introduit [346]. Il s’agit d’un acide phosphinique, dont l’acidité est plus forte que celle d’un acide carboxylique, afin de déplacer l’équilibre de la réaction dans le sens d’une réaction totale (cf Figure II- 2).

Figure II- 2 : Représentation schématique d’un tensioactif catanionique tricaténaire dérivé de sucre.

Le tensioactif catanionique tricaténaire dérivé de sucre préparé au laboratoire a fait l’objet d’une caractérisation physico-chimique [55, 56, 330] mettant en évidence des propriétés prometteuses d’association sous forme de vésicules et d’encapsulation de marqueurs hydrophiles. Avant d’envisager l’utilisation de telles vésicules pour la vectorisation de principes actifs, nous avons optimisé leurs propriétés de biocompatibilité et de stabilité. Pour cela, nous avons amélioré la méthode de synthèse ainsi que la structure du tensioactif catanionique tricaténaire.

2.2.

Optimisation du procédé de synthèse d’un tensioactif

précurseur, le N-alkylamino – 1 - déoxylactitol

Le N-alkylamino – 1 - déoxylactitol, désigné ultérieurement par le terme générique « L- Hyd », est un tensioactif à tête sucre, précurseur de l’amphiphile cationique qui constitue le tensioactif catanionique. Sa synthèse a été effectuée par une réaction d’amination réductrice à partir d’-lactose. L’alkylamine greffée possède soit 16 soit 12 carbones, formant respectivement le N-hexadécylamino-1-déoxylactitol (L-Hyd16) et le N- dodécylamino-1-déoxylactitol (L-Hyd12) (cf Figure II- 3).

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Figure II- 3 : Synthèse du L-Hyd en deux étapes: (1) amination de l’-lactose par une alkylamine, (2) réduction de l’imine (soit par NaBH4, soit par H2 sur Pd/C).

La synthèse de L-Hyd16, mise au point au préalable au sein du laboratoire [337, 338], utilise du borohydrure de sodium (NaBH4) comme agent réducteur de l’imine. Cependant,

l’élimination des traces de bore est une étape relativement délicate à réaliser et à adapter à grande échelle, le bore ayant une grande affinité pour les sucres porteurs de groupements cis diols, comme le galactose. C’est pourquoi le procédé de synthèse du L-Hyd16, particulièrement l’étape de réduction de l’imine, a été optimisé en remplaçant la réduction au NaBH4 par une hydrogénation sous pression d’hydrogène en utilisant un catalyseur

régénérable, le palladium sur charbon (Pd/C), dont l’emploi a été envisagé dans le cadre de la thèse d’E. Soussan [330].

En utilisant cette synthèse au dihydrogène, la longueur de chaîne du L-Hyd a du être raccourcie de 16 à 12 carbones afin de réduire l’hydrophobie globale du tensioactif et ainsi d’améliorer sa solubilité en milieu aqueux. Ainsi, trois synthèses de L-Hyd ont été réalisées. Comme la plupart des tensioactifs, le L-Hyd possède la propriété de s’auto-organiser en milieux aqueux afin de réduire le contact de sa partie hydrophobe avec le solvant : il forme spontanément des micelles [347].

Ces assemblages supramoléculaires peuvent être caractérisés par plusieurs paramètres physico-chimiques, notamment la Concentration Micellaire Critique (CMC) et le point de Krafft. La CMC correspond à la concentration minimale à partir de laquelle les tensioactifs s’associent spontanément sous forme de micelles en solution. Cette valeur est définie pour une température donnée. La température de Krafft, quant à elle, est la température minimale au-dessous de laquelle le tensioactif ne forme plus de micelles car il cristallise, même si sa concentration dans la solution est supérieure à sa CMC.

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Le Tableau II- 1 récapitule les données de CMC et température de Krafft, ainsi que la tension de surface de la solution pour une concentration supérieure ou égale la CMC, pour les trois types de L-Hyd susmentionnés.

L-Hyd16