Préparation de l'élastomère

gure 4.3). Cependant, pour des motifs susamment grands, ils disparaissent. La réalisation d'étapes assez courtes (ici 3 s d'attaque et 2,2 s de passivation) permettent également de limiter le phénomène. La vitesse de gravure dépend tout de même de

Figure 4.4  Vue en coupe en microscopie électronique à balayage d'un wafer de silicium creusé par procédé Bosch. Les anneaux évoqués sont présents - barre=2 µm

la taille des motifs. En eet, s'ils sont petits (de l'ordre de 1 µm), le gaz peut moins facilement entrer dans les trous formés par la résine, et il faut donc calibrer son temps d'attaque en fonction de la section des motifs. Enn, même si la vitesse de gravure est moindre pour la résine qui sert de masque (∼ 0, 3 µm/min pour celles employées), il faut prévoir une couche susamment importante pour qu'elle ne soit pas complètement détruite et que le silicium ne soit pas attaqué uniformément. Après la gravure, il est nécessaire de retirer la résine. Il est possible d'utiliser des bains chimiques pour dissoudre la résine restante (acétone et isopropanol pour les résines employées) ou de faire une attaque au plasma O2, qui va la détruire sans mo-

dier le substrat en silicium. Le moule est alors prêt à être utilisé. Pour le protéger, augmenter sa durée de vie et faciliter le démoulage de l'élastomère, on le silanise avec un uorosilane. Ceci a pour conséquence de rendre la surface encore plus hy- drophobe. Il ne reste plus qu'à utiliser les motifs creusés dans la plaque de silicium en tant que moules (voir étape 3 gure 4.2).

4.2 Préparation de l'élastomère

Pour nos expériences, nous avons utilisé un élastomère couramment employé en microuidique, le Poly DiMéthyl Siloxane (PDMS) (formule donnée gure 4.5). Ce matériau présente de nombreux avantages en biologie :

 Il est biocompatible. Le milieu de culture cellulaire ne contiendra donc pas de substance relarguée par le PDMS qui modie le comportement cellulaire. On

peut également noter que le PDMS est perméable aux gaz, dont l'oxygène, ce qui permet de meilleurs échanges entre les cellules et leur milieu de culture ;  Il est optiquement transparent et non uorescent. Il est donc possible d'imager

en microscopie optique, la lumière pouvant traverser l'échantillon. La taille et la structure des plots font qu'ils jouent le rôle de guide d'ondes, et apparaissent blanc sur fond noir ;

 Il est possible de traiter sa surface avec des protéines d'intérêt (telles que des protéines de la matrice extra-cellulaire comme la bronectine), qui vont servir d'ancrage aux cellules. On peut donc facilement faire adhérer des cellules à sa surface. On peut également accrocher d'autres molécules, telles que du silane, qui va permettre de créer des zones adhésives coexistant avec des zones non- adhésives.

Dans nos expériences, nous avons utilisé du Sylgard®184. Cet élastomère est

Figure 4.5  Formule du PDMS

constitué de deux composants, la base et le réticulant. Le mélange standard est de une masse de réticulant pour dix masses de base. Nous le cuisons alors toute une nuit à 65‰. En fonction de la proportion de réticulant et du temps de réticulation, les propriétés mécaniques du PDMS varient. Etant donné que l'on s'intéresse à l'inuence de la rigidité du substrat sur le comportement cellulaire, les propriétés mécaniques de celui-ci doivent être contrôlées régulièrement.

4.2.1 Démoulage du PDMS

Lorsqu'on a coulé et fait réticuler le PDMS sur le moule, il faut ensuite démouler les plots et les récupérer en bon état. Pour cela, le démoulage se fait en fonction du rapport d'aspect et de la raideur. En eet, si les plots sont souples et si leur densité est élevée, les contraintes exercées sur les plots lors du démoulage vont les dééchir, et ils vont toucher leurs voisins. Or les interactions PDMS-PDMS font qu'il est dicile de séparer deux plots qui se touchent. Il n'est alors plus possible d'utiliser ce réseau. On peut remédier à cette contrainte en démoulant les plots dans de l'éthanol. On a, pour le PDMS et l'éthanol à 70% : γlv = 37 nN/µm. On peut alors comparer γlv à la raideur k des plots. Si cette raideur k est supérieure à γlv,

4.2. Préparation de l'élastomère 71

Figure 4.6  Le module d'Young est déni comme étant égal à E = F L0

A0∆L avec F la force

exercée sur la section A0 d'un objet de longueur à vide L0 et ∆L la variation de longueur

sous la contrainte F/A0. On utilise un cylindre de PDMS aux dimensions calibrées sur lequel

on exerce une force croissante. La hauteur L0− ∆L est enregistré grâce à un capteur. On

peut alors déterminer E

les plots ne se coucheront pas si le substrat est séché. En dessous de γlv, les plots se coucheront. Nous avons donc maintenant un substrat prêt à l'emploi.

4.2.2 Amélioration du substrat : un réseau permettant une

observation par objectif à immersion à huile

Lorsqu'on utilise un microscope inversé, l'observation de l'échantillon est fonction de la distance de travail de l'objectif : pour un objectif à faible grossissement (jusqu'à 20X), elle peut atteindre plusieurs mm, tandis que pour un objectif à immersion à huile, elle n'est que de quelques centaines de µm. (voir gure 4.7) Pour pouvoir

Figure 4.7  A : réseau de plots obtenu en coulant le PDMS de façon classique. B : réseau de plots sur lamelle, pour pouvoir observer avec un objectif à immersion à huile

100X à immersion à huile), nous avons mis au point un substrat n recouvert de plots, dont l'épaisseur avoisine les 200 µm (voir schéma 4.8). Voici les diérences avec le mode opératoire classique. Alors qu'avec le protocole classique il est possible de préparer plusieurs substrats à la fois, notamment lorsqu'ils sont contigus sur le même wafer, cette préparation est individuelle.

Figure 4.8  Fabrication de plots sur lamelle pour une observation jusqu'au 100X à immersion à huile

 pour un réseau de plots, on dépose une petite quantité de PDMS comme indiqué sur le schéma 4.8 ;

 on dégaze à nouveau le PDMS. Cette étape est essentielle pour la reproducti- bilité des réseaux ;

 on dépose de part et d'autre de la bande de PDMS dégazé des espaceurs (ici des lamelles) puis une autre lamelle, plus grande. Elle va servir de support au PDMS. Les espaceurs et la lamelle sont choisis de telle sorte que l'épais- seur globale de cet échantillon soit équivalente à une lamelle classique, soit

∼ 200 µm. On fait réticuler ;

 on démoule ensuite les réseaux dans de l'éthanol à 70% quelle que soit la rigidité des plots (voir Annexes pour le détail). Si les plots sont susamment rigides, il est possible de les laisser sécher à l'air libre après démoulage. On peut ensuite les traiter comme un réseau classique.