On rappelle que la nomenclature des plots est (H-D-S) pour hauteur, diamètre et espacement. Pour cette étude, nous avons utilisé un seul type de plots, des (20- 5-12), su samment espacés pour que la cellule se dépose entre les plots, tout en interagissant avec eux. Nous avons ensuite xé et marqué les cellules.
9.2. Morphologie lors de l'étalement cellulaire 133
Figure 9.1 Vues du dessus (A, B, C) et coupes selon l'axe représenté (A', B', C') pour des cellules xées à diérents temps : 15 min (A et A'), 30 min (B et B') et 1h (C et C'). Le noyau apparaît en bleu, le corps cellulaire en vert (visualisé grâce à l'ajout de calcéine AM). Barre = 5 µm.
Lors de l'étalement cellulaire sur des plots, la cellule va occuper aussi bien le sommet des plots que l'espace inter-plots. Pour un espacement S∼8 à 12 µm, les premières étapes d'étalement se font sur deux ou trois plots, le corps cellulaire se plaçant au milieu d'eux. Au tout début de l'étalement (t < 15 min) la cellule est posée sur le haut des plots et pénètre déjà entre les plots, où on trouve notamment le noyau (voir image A' de la gure 9.1). Dès cet instant (t=15 min), les plots sont dé échis par la cellule alors même qu'aucune adhésion focale n'est clairement visible le long des plots (voir image A de la gure 9.2).
Par contre, dès 30 min après le dépôt des cellules, la paxilline s'est assemblée en complexes que l'on trouve sur le haut mais également sur le côté des plots. La morphologie de la cellule évolue également. On peut également relever que pour
t ∼ 15min, la convexité de la cellule change. En eet, lorsqu'une cellule se dépose sur un substrat, elle est ronde. Sur un substrat plan, elle va s'étaler en se polarisant tout en restant convexe. Par contre ici, comme on peut le voir sur l'image A de la gure 9.1 les structures reliant les plots sont, pour deux d'entre elles, encore convexes, tandis que celle de gauche est devenue concave. Cette concavité sera conservée ensuite,
Figure 9.2 Vues du dessus (A, B, C) et coupes selon l'axe représenté (A', B', C') pour des cellules xées à diérents temps : 15 min (A et A'), 1 h (B et B') et 2 h (C et C'). L'actine apparaît en rouge, la paxilline en vert. Barre = 5 µm
comme on peut le voir sur les images B et C de la même gure, et n'a pas de point de comparaison avec une morphologie cellulaire sur substrat plan. Tant que t < 1 h, les cellules sont suspendues entre les plots, puis la cellule adhère au socle des plots. Le mécanisme d'étalement des cellules est donc le suivant :
dès que la cellule touche les plots, elle va s'ancrer à 2 ou 3 plots (en moins de 2 min). L'aire de la cellule dans le plan d'observation, une fois ancrée aux plots, ne changera pas jusqu'à ce que la cellule atteigne le socle des plots. L'étalement va donc être principalement vertical et nous ne pourrons pas voir si, comme sur un substrat plan, l'aire varie en loi de puissance (Dobereiner et al., 2004) ;
la cellule occupe l'espace inter-plots. Le noyau pénètre entre les plots et la cellule adhère le long des plots. On note la présence de complexes focaux sur le haut des plots, mais également sur la surface latérale. Si on peut signaler l'absence de bres de stress visibles dans le cytoplasme (voir images A, B et C de la gure 9.2), on trouve sur le pourtour cellulaire un câble d'actine enserrant les plots. On retrouve ce signal d'actine sur toute la longueur des plots occupée par la cellule. Par ailleurs, les adhésions focales sont également
9.2. Morphologie lors de l'étalement cellulaire 135
Figure 9.3 Cellule entre deux plots dans deux con gurations caractéristiques : Dans les 15 premières minutes (gauche) et à partir de 30 minutes. On peut noter que le rayon de courbure R1 est inférieur à R2, l'écart s'accentuant au court du temps.
localisées en majorité sur l'extérieur des plots. On a donc une nappe d'actine qui enserre les plots, auxquels elle est liée par le biais d'adhésions focales ; la cellule, en adhérant entre les plots, exerce des tensions en formant des adhé-
sions focales (dès t = 30 min). On les trouve à la fois sur le haut et sur les surfaces latérales des plots. Au cours du temps, alors que la surface d'adhésion le long des plots augmente, le rayon de courbure1 de la cellule dans le plan
(xOz) lui diminue, celui du haut de la cellule étant plus toujours inférieur à celui du bas (voir gure 9.3) ;
au bout d'environ 1h, la cellule adhère au socle du substrat, et occupe à la fois l'espace inter-plots en s'étalant entre les plots et toute la longueur des plots (voir image C' de la gure 9.2). Sur le socle du substrat elle va former des complexes focaux ressemblant à ceux observés sur un substrat rigide et plan, ce qui constitue une des limites à notre modèle approchant le 3D.
Tant que les cellules sont suspendues entre les plots, on a donc des surfaces adhésives (les plots) séparées par un espace non adhésif (l'espace inter-plots).
On retrouve en fait un patron utilisé par Théry et al. (2006). En eet, tout comme dans cette étude, nous avons des zones d'adhésion séparées par des zones non adhésives (ici les cellules sont suspendues entre les plots). On observe alors un renforcement de l'actine en suspension entre les plots, comme on peut le constater déjà sur l'image A de la gure 9.2, et encore mieux sur l'image B de la même gure. Ce renforcement de l'adhésion peut être couplé à la dé exion des plots que l'on observe dès le début de l'étalement (voir image A'
de la gure 9.1, plot de droite).
1. la cellule présente deux surfaces libres d'adhésion, visibles par exemple sur les images B' et C' de la gure 9.1. On peut déterminer les rayons de courbure de ces surfaces
Nous avons souhaité ensuite évaluer la dynamique des cellules lorsqu'elles pé- nètrent dans les plots, en étudiant le déplacement des plots au cours de l'étale- ment.En utilisant des REF52, qui expriment de façon stable la paxilline-YFP, nous avons observé en même temps la formation des adhésions focales.