Microscopie confocale à balayage

identique à celui du microscope droit. Le montage est inversé par rapport au mi- croscope droit : l'éclairage se fait par le dessus et le signal est récupéré en fond clair par l'objectif situé en dessous de l'échantillon (voir gure 5.3). Tout comme le microscope droit, la thermalisation à 37‰ du système est assurée par une enceinte munie d'une souerie. Sur ce système, nous avons une platine motorisée, pilotée par Metamorph (MetaImaging Series). Nous pouvons donc acquérir de multiples champs d'observation séquentiellement, ce qui permet d'augmenter le nombre de cellules ob- servées au cours d'une même expérience, dans les mêmes conditions expérimentales. La lumière doit traverser l'échantillon, nous sommes donc obligés d'utiliser soit des objectifs dont la distance de travail est grande (on peut utiliser tous les objectifs à air, jusqu'au 60X), soit d'utiliser le substrat présenté partie 4.2.2 (avec des objectifs à huile). Nous avons principalement utilisé un 20X à air, qui permet d'acquérir des images même à travers une boîte de Pétri, et des 40X, 60X et 100X à huile. Les images ont été acquises avec une caméra CCD (CoolsnapES).

5.2 Microscopie confocale à balayage

Comme on l'a vu précédemment, la microscopie par épiuorescence intègre le signal émis par les uorophores sur toute l'épaisseur de l'échantillon. Il n'est donc pas possible de localiser avec précision le plan où a lieu l'événement étudié. Pour pallier à cet inconvénient, nous avons utilisé la microscopie confocale. Le principe est le suivant :

On utilise un ou plusieurs lasers, qui permettent de couvrir la gamme de longueurs d'onde correspondant aux marquages. On peut alors exciter les uorochromes d'in- térêt. A l'aide de déecteurs, on va pouvoir balayer tout le plan focal (d'où le nom de microscope confocal à balayage). Bien que le laser soit focalisé, le plan focal de l'échantillon n'est pas le seul à recevoir la lumière. En eet, comme dans le micro- scope à épiuorescence, les uorochromes présents sur le trajet lumineux sont eux aussi excités par le laser, et c'est donc un signal intégré qui arrive au détecteur. Pour séparer le signal provenant du plan focal du signal parasite, un tri est opéré en amont du détecteur, à l'aide d'un diaphragme dont le diamètre est de∼ 100 µm (d'où son nom de pinhole) (voir gure 5.4). En eet, seul le signal provenant du plan focal (sur une épaisseur variant en fonction de la longueur d'onde et du diamètre du pinhole) pourra pénétrer dans le détecteur, le reste du signal étant bloqué par le diaphragme. Il est donc possible d'obtenir un signal intégré uniquement sur quelques centaines de nm et ce, sur toute l'épaisseur de l'échantillon, dans la limite de la profondeur de champ de l'objectif. On peut donc obtenir, en choisissant bien le pas entre deux plans successifs, une répartition 3D des signaux d'intérêt. Une fois le signal récupéré, il va être amplié à l'aide de photomultiplicateurs pour améliorer le rapport signal sur bruit. L'avantage du microscope confocal est principalement sa résolution spatiale très supérieure à celle d'un microscope en épiuorescence. En eet, le bruit de fond

continu dû aux plans entourant le plan focal peut être supprimé, ce qui permet une détection plus sensible et une meilleure dénition. De plus, on peut non seulement réaliser une pile d'images selon Z, mais également latéralement ce qui n'est pas du tout accessible avec un microscope classique. Cependant, la résolution temporelle

Figure 5.4  Principe de fonctionnement du microscope confocal

du microscope confocal est faible : dans les conditions d'acquisition que nous avons employées3_{, nous avons un temps d'acquisition de 2,64 s par image, alors que nous}

descendons à quelques centaines de ms en épiuorescence. En eet, acquérir la zone d'intérêt en la balayant prend du temps. De plus, ce mode d'acquisition induit le photoblanchiment de l'échantillon. Une observation sur échantillon vivant ne permet donc pas de cadence élevée, sous peine de décroissance de la uorescence très rapide et donc de perte de signal. C'est pour cela que nous avons, dans cette étude, employé le confocal à balayage uniquement sur cellules xées.

Chapitre 6

Modèle par éléments nis : COMSOL

Sommaire

6.1 Principes généraux . . . 84 6.1.1 Contrainte, déformations et élasticité . . . 84 6.1.2 Relation d'équilibre . . . 85 6.2 Fabrication du modèle de plots dans un socle en PDMS 85 Pour déterminer les forces à partir du déplacement, nous avons jusqu'à présent utilisé la relation linéaire F = k∆x où k est la constante de raideur d'un plot et ∆xle déplacement mesuré. Néanmoins, nous avons voulu vérier jusqu'où cette hy- pothèse était valable, mais également déterminer les forces dans des congurations diérentes : forces exercées sur une partie de la surface latérale par exemple. Pour cela, nous avons utilisé un logiciel de simulation par éléments nis, COMSOL. Ce logiciel est disponible au laboratoire grâce à Philippe Dantan, qui nous a aidé à réa- liser ces simulations. Nous allons pour le moment présenter uniquement le principe, les résultats seront intégrés aux parties expérimentales correspondantes.

6.1 Principes généraux

La méthode des éléments nis permet de résoudre numériquement des équations aux dérivées partielles (EDP) linéaires que l'on ne peut pas résoudre autrement. Pour pouvoir résoudre ces équations, l'objet est découpé en polyèdres qui constituent un maillage approché de l'objet. Ce maillage, en fonction de la précision recherchée et de la puissance de calcul disponible, peut être adapté. Il faut chercher un compro- mis permettant d'obtenir une solution convergente, stable, et unique du problème dans la limite de la puissance de l'unité de calcul employé. Une fois choisies, ces mailles auront pour nous la forme de triangles équilatéraux formant donc des tétra- èdres. L'objet continu a été discrétisé. On peut alors, sur chaque élément, résoudre numériquement les équations d'équilibre de forces grâce à ses petits déplacements. Nous allons dorénavant prendre l'exemple des équations d'élasticité de mécanique des structures que nous avons employées pour illustrer le mode de calcul.

6.1.1 Contrainte, déformations et élasticité

Pour décrire les contraintes en un point, on caractérise le tenseur des déforma- tions ² à l'aide des déplacements (u, v, w) de la façon suivante :

²x= ∂u_∂x ²xy = 1₂(∂u_∂y + ∂v_∂x)

²y = ∂v_∂y ²yz = 1₂(∂v_∂z +∂w_∂y) ²z = ∂w_∂z ²xz = 1₂(∂u_∂z + ∂w_∂x) on a alors ² =  _²²_xyx ²_²xy_y ²_²xz_yz ²xz ²yz ²z   _(6.1)

Ce tenseur des déformations est lui-même relié au tenseur des contraintes σ par la relation

σ = D²

où D est la matrice d'élasticité, matrice symétrique dont les paramètres sont E, module d'Young et ν coecient de Poisson du matériau. On a :

σ =  _τσ_xyx τ_σxy_y τ_τxz_yz τxz τyz σz  

Le module d'Young E est déni par la loi de Hooke

6.2. Fabrication du modèle de plots dans un socle en PDMS 85