Inuence du noyau

Les noyaux dans les plots s'adaptent à l'espace disponible. En eet, lorsqu'une cellule est étalée sur une surface plane, son noyau est régulier, ovale. Si on dépose des 3T3 sur des plots, les noyaux vont se déformer pour s'adapter à la topographie.

8.2. Rôle de l'espacement entre les plots 127 plat plots 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 p r o p o r t i o n d e ce l l u l e s (20-5-4) (20-5-6) (20-5-8) (20-5-12)

Figure 8.17  Pourcentages respectifs des cellules restant à la frontière côté PDMS plat (gauche) et de celles passant dans les plots lorsqu'elles arrivent à la frontière plots-plat (droite)

Un exemple est donné gure 8.18.

Figure 8.18  A : Cellules sur des plots (25-5-10), dont le noyau a été marqué. En insert, les deux noyaux sans les plots ; B : noyau d'une cellule sur une surface plane ; C : Cellules sur des plots (25-10-5), dont le noyau a été marqué. En insert, les deux noyaux sans les plots. Barre=10 µm

Les propriétés mécaniques du noyau peuvent donc être le facteur limitant d'entrée dans les plots. Un module d'Young dynamique E a été déterminé, il a été montré qu'il varie en loi de puissance : E = Bt−α _{(Dahl et al., 2005). Pour comparer deux} rigidités de noyau, nous avons utilisé un plasmide codant pour une protéine du noyau, la lamine A. Son mode d'action a été détaillé partie 1.1.1. Dahl et al. (2006)

ont déterminé expérimentalement le module d'Young dynamique de noyaux sains et l'ont comparé à celui mesuré sur des patients atteints de progéria. Ils ont trouvé que B ne varie pas signicativement avec les propriétés de la lamine, mais que par contre, la dynamique, caractérisée par α, change : la puissance est deux fois plus faible pour les cellules dont la lamine-A est tronquée (0,18). La déformation sous contrainte dynamique est donc plus dicile lorsque le noyau contient de la lamine-A ∆50 et donc les noyaux de patients sont plus rigides que les noyaux sains.

Nous avons donc transfecté les 3T3 avec le plasmide lamine A-∆50, donné par Kris Dahl (Carnegie Mellon, Pittsburgh). Après 24 heures d'incubation, nous avons trypsiné les cellules et les avons déposé sur les plots. Comme pour les expériences de migration évoquées plus haut, nous avons ensuite enregistré les migrations cellulaires sur 12 heures en diérentes positions, en combinant uorescence et champ clair.

Le taux de transfection étant très faible, nous n'avons obtenu qu'un faible nombre (5) de cellules transfectées migrant du plat vers les plots. Néanmoins, toutes ces cellules déposées sur plots (20-5-6), espacement où une majorité de cellules entraient dans les plots, sont restées sur le plat. Il semble donc que la rigidité du noyau joue bien un rôle dans la migration cellulaire au sein d'un environnement texturé, notamment au niveau de la taille des  pores  dénis par les plots. Des expériences contrôles que nous sommes en train d'eectuer viseront à conrmer ce résultat, en contrôlant que ce n'est ni la modication du noyau (contrôle grâce à un plasmide codant pour la lamine A-GFP saine) ni la transfection (contrôle avec un plasmide GFP) qui entraîne cette modication.

8.3 Conclusion

Nous avons donc montré ici qu'avec un substrat texturé, dont on peut varier les dimensions de façon contrôlée, on pouvait sonder les propriétés cellulaires. En eet, les cellules modient leur comportement même lorsque les variations du substrat peuvent sembler ténues : une variation de hauteur de quelques µm sut à modier la migration cellulaire, comme on a pu le voir sur le MSD. Lorsqu'on augmente la hauteur des plots, le temps de cross-over augmente et le coecient de diusion diminue, ce qui caractérise la persistance de la migration cellulaire. Par ailleurs, un espacement inter-plots diminué de 2 µm sut à rendre l'interface plots-plat quasi infranchissable depuis la surface plane. Bien qu'on ne puisse pas considérer ce substrat constitué de plots comme étant un véritable environnement 3D (il n'est pas isotrope, et les cellules peuvent trouver, entre les plots, une surface plane), on retrouve des caractéristiques identiques entre ces plots et un gel tridimensionnel :

 les cellules ne sont complètement étalées, elles adhèrent aussi le long des plots et s'en servent comme point d'appui pour migrer, comme celles qui migrent de façon mésenchymateuse en 3D.

 la migration est dirigée : dans un gel tridimensionnel, les cellules peuvent migrer le long des bres le constituant.

8.3. Conclusion 129  les bres de stress sont quasiment absentes, les seules structures d'actine ren-

forcées sont dues à la présence des plots.

 Alors même que les cellules sont déposées sur un substrat plan entre les plots, le fait qu'elles soient adhérentes aux surfaces latérales des plots entraîne une concentration d'adhésions focales plus faible sur le substrat plan.

On a pu alors en dégager des caractéristiques aussi bien au niveau du comporte- ment global de la cellule (migration) qu'au niveau intra-cellulaire (réorganisation). Cependant, nous avons jusqu'à présent considéré comme un prérequis l'étalement de la cellule dans cet environnement. Nous allons donc, de façon préliminaire, nous intéresser à cette première étape.

Chapitre 9

Étalement cellulaire dans un

environnement  3D 

Sommaire

9.1 Modes opératoires employés . . . 132 9.2 Morphologie lors de l'étalement cellulaire . . . 132 9.3 Analyse temporelle de l'étalement cellulaire . . . 136 9.3.1 Substrats texturés adhésifs . . . 137 9.3.2 Contrôles . . . 145 9.4 Conclusion : proposition de modèle d'étalement . . . 147 Dans cette partie, nous avons combiné les travaux précédents pour étudier les forces lors de l'étalement des cellules dans un environnement mimant un milieu 3D. Pour cela, nous avons utilisé des plots d'espacement variable (S=4 à 12 µm), de diamètre 5 µm et de hauteur 20 µm. Ils sont donc beaucoup plus exibles qu'aupa- ravant. Jusqu'à présent, nous avons eectué des expériences sur cellules en contact avec leur substrat depuis plusieurs heures. Ici, nous nous intéresserons à la géné- ration de forces lors des premières étapes de l'adhésion dans un environnement où les plots, de diamètre 5 µm et d'espacement variable, peuvent être dééchis par les cellules. La dynamique de l'étalement a déjà fait l'objet d'études sur des substrats bidimensionnels (Dobereiner et al., 2004; Dubin-Thaler et al., 2004) : au cours de l'étalement, l'aire cellulaire augmente, et on peut distinguer plusieurs régimes : des bourgeonnements de membrane (blebbing) dans un premier temps, de la protrusion ensuite, des oscillations enn (Giannone et al., 2004). Au cours de cet étalement, les cellulent exercent des forces, le cytosquelette se réorganise. Récemment, dans des études à 2D, la troisième dimension est prise en compte : il a été montré que lors de son adhésion, la cellule (un monocyte) détecte la surface lorsque celle-ci se situe à 50 nm et ce, sur des échelles de temps très courtes (quelques secondes) (Pierres et al., 2008). Nous avons donc voulu ensuite connaître les mécanismes d'étalement des cellules dans les environnements de plots employés précédemment.

9.1 Modes opératoires employés

Pour caractériser l'étalement cellulaire, nous avons déposé les cellules (des REF52 exprimant la paxilline-GFP) sur des micro-piliers en PDMS de raideur ∼ 400 nN/µm. Ceux-ci avaient été préparés suivant le même protocole que pour l'étude sur la mi- gration. L'ensemble du substrat est traité avec de la bronectine. Néanmoins, pour suivre la déformation du substrat, nous avions préalablement imprimé de la bro- nectine uorescente sur le haut des plots. Cela nous a permis de suivre avec une meilleure précision le mouvement des plots induit par la contraction cellulaire. Nous n'avons utilisé que des plots de 5 µm de diamètre, hauts de 20 µm pour avoir des plots susamment souples. Nous avons fait varier la densité de plots entre 10 et 33%.

Dans tous les cas, la cellule déposée va commencer par s'étaler sur les plots puis pénétrer entre les plots. L'étalement a lieu en 3 dimensions, et il est dicile de réa- liser une étude en dynamique qui permettrait d'avoir accès à l'ensemble du volume d'intérêt. En eet, un essai avec un microscope confocal à spinning-disk ne s'est pas avéré concluant : le signal était trop faible pour pouvoir suivre l'évolution de la paxilline-YFP au delà de quelques min sans détruire la uorescence. Pour caracté- riser leur comportement, nous avons donc utilisé deux techniques, pour avoir accès à la fois aux 3 dimensions et à la dynamique, mais de façon découplée :

 en dynamique, en imageant le haut des plots pour suivre leur déplacement. Nous avons également, grâce à un PiFoc, enregistré le signal de la paxilline- YFP sur plusieurs plans, en haut des plots, au milieu et en bas. Ces acquisitions ont été réalisées en épiuorescence.

 en xant, dans du paraformaldéhyde, des cellules à diérents instants : 15 min, 30 min, 1h et 2h après le dépôt des cellules sur les plots. Nous avons ensuite marqué l'actine, la paxilline exprimée, caractérisant les adhésions focales, étant déjà couplée à une protéine uorescente. Nous avons renouvelé l'expérience en marquant le noyau avec du DAPI (voir protocoles en annexe) sur des cellules qui avaient été incubées avec de la calcéine AM (BD Biosciences) avant la trypsinisation. Ces échantillons ont ensuite été imagés par microscopie confo- cale, pour étudier la répartition spatiale du cytosquelette et du noyau. Pour cela, nous avons eectué des coupes en Z mais également en Y, pour avoir la répartition des protéines d'intérêt le long des plots.

Nous allons commencer par nous intéresser aux cellules xées.