Étalement cellulaire et taille des adhésions focales

Figure 7.7  A, C, E : Surfaces recouvertes par de la bronectine, permettant aux cellules de s'étaler. B, D, F : Etalement eectif des cellules sur les surfaces correspondantes. G : Forces moyennes par plot exercées sur les plots en fonction de l'étalement. Elles croissent avec la surface disponible, d'après Tan et al. (2003). Barre = 10 µm

constaté une augmentation de l'aire moyenne des cellules avec la rigidité, s'étendant de 500 à 1600 µm2_{, sur une gamme de raideur de 17 à 1700 nN/µm (voir gure 7.8).}

Ceci est en bon accord avec les données obtenues sur gels continus.

Figure 7.8  Aire moyenne des cellules en fonction de la rigidité des plots

Pour connaître la morphologie des adhésions focales, nous avons étudié la vinculine, qui peut servir de marqueur de la formation des adhésions focales. Pour cela, nous avons xé et marqué par immunouorescence (voir protocole en annexe) des cellules adhérant sur le haut des plots. Sur substrat rigide (85 nN/µm), les adhésions focales

sont très marquées et assez grandes tandis que sur substrat mou (13 nN/µm) la distribution de la vinculine est plus diuse et on ne voit pas d'adhésion focale (voir gure 7.9).

Figure 7.9  Marquage de la vinculine par immunouorescence dans des 3T3. A : k=85 nN/µm, les adhésions focales sont situées sur le haut des plots et bien marquées. B : k=13 nN/µm, la vinculine ne forme que de petits contacts focaux peu intenses et dius

Dans un environnement constitué de micro-piliers à section elliptique (voir2.1.2), nous avons montré précédemment que des îlots de cellules épithéliales s'orientent selon la plus grande rigidité (Saez et al., 2007). Nous avons donc voulu vérier si cette orientation privilégiée se retrouvait sur une cellule individuelle. En eet, le modèle théorique, décrit partie 2.1.2, prédit qu'un substrat anisotrope pourrait sur à orienter une cellule (Bischofs et Schwarz, 2003) lors de l'étalement cellulaire. En utilisant les mêmes plots ovales que Saez et al. (2007) (de grand axe égal à 2 µm et de petit axe valant 1 µm, la hauteur variant de 3 à 6 µm), il est possible de créer un environnement dont la rigidité est anisotrope. On peut alors étudier l'inuence de la variation de rigidité au sein d'une même cellule. Les raideurs des plots sont, selon les deux axes principaux :

k⊥ = 3 32πE a4 L3 (7.5) k = 3 8πE a4 L3 (7.6) On a donc : k⊥ k = 1 4

la plus grande raideur étant selon le grand axe des plots.

Les plots ont été recouverts de bronectine et des 3T3 y ont été déposés en les laissant s'étaler toute une nuit à 37‰. On peut alors les observer et comparer leur orientation à celle des plots, en déterminant leur ellipticité et, le cas échéant, l'angle que fait l'axe principale de la cellule avec le grand axe des plots. Les cellules se sont orientées selon la plus grande rigidité, tout comme leur cytosquelette (voir

7.4. Étalement cellulaire et taille des adhésions focales 101 gure 7.10). En déterminant l'angle entre le grand axe des cellules et celui des plots, on constate (image B de la gure 7.10) que l'orientation se fait selon le grand axe des plots. C'est ce qui avait déjà été observé pour les cellules épithéliales MDCK (Saez et al., 2007). Cependant, ces substrats présentent aussi une anisotropie géométrique.

Figure 7.10  (A) : image en microscopie électronique d'un broblaste sur des plots ovales. Il est orienté selon la plus grande rigidité. (B) : distribution de l'orientation des cellules. L'angle 0° correspond à la plus grande rigidité. (C) : 3T3 dont le cytosquelette d'actine a été marqué. Les bres de stress sont également orientées selon la plus grande rigidité. Barres = 50 µm (A) et 10 µm (B)

Or, il a été montré que des textures orientent les 3T3 (c'est le guidage par contact détaillé partie 3.3.1). Avec les plots ovales, on ne peut donc pas savoir si l'orientation préférentielle est due à la diérence de rigidité ou au contact guidance. Nous avons donc eectué des expériences de contrôle pour vérier que l'orientation observée était bien due à l'anisotropie de la raideur. L'idée est donc d'utiliser un substrat où seule la géométrie est anisotrope, la raideur restant constante. Nous avons eu l'idée d'imprimer un réseau constitué d'ovales sur une lamelle de verre. On transfère le motif constitué de plots ovales et les propriétés adhésives sont donc anisotropes. Mais dans le même temps, le substrat support, la lamelle de verre, a la même rigidité quelle que soit la direction observée. On a donc bien découplé la géométrie de la raideur. Pour conserver cette anisotropie d'adhésion, on dépose entre les motifs une brosse de polymères, du PEG, pour que la cellule n'adhère que sur les patchs de bronectine.

Si on observe toujours une orientation privilégiée alors que la raideur est constante, nous pourrons conclure que l'orientation sur les plots ovales est due à du guidage par contact. Si au contraire, les cellules n'ont pas d'orientation privilégiée sur la lamelle micro-imprimée, l'allongement des cellules selon le grand axe des plots est dû à variation de la raideur. Pour obtenir cette surface, on utilise la technique de micro-contact printing décrite partie 4.3. Tout comme les cellules épithéliales, ni les cellules ni leur cytosquelette d'actine ne présentent une orientation privilégiée. C'est donc bien la rigidité qui commande cette orientation et non le guidage par contact.

Figure 7.11  A Cellules sur lamelle de verre sur laquelle est imprimée un motif en bro- nectine constitué d'ovales. Les cellules ne sont pas orientées selon la direction privilégiée. A : Organisation du cytosquelette d'actine sur une lamelle tamponnée d'un motif constitué d'ovale. Les bres de stress ne sont pas orientées selon la direction privilégiée. Barres = 20 µm