Fabrication du modèle de plots dans un socle en PDMS

matériau ne soient pas atteintes). Le PDMS que nous utilisons a un module d'Young égal à 2 MPa.

Le coecient de Poisson quant à lui permet de caractériser la contraction du matériau perpendiculairement à la direction d'application de la force. Lorsqu'un matériau est incompressible, son coecient de Poisson ν est égal à 1

2. Ce sera le cas

ici.

6.1.2 Relation d'équilibre

En éléments nis, il est dicile de résoudre des problèmes à 3 dimensions en dynamique. Nous avons donc résolu une succession de points d'équilibre.

Cette relation d'équilibre est la suivante :

−∂σx ∂x − ∂τxy ∂y − ∂τxz ∂z = Fx (6.2) −∂σy ∂y − ∂τxy ∂x − ∂τyz ∂z = Fy (6.3) −∂σz ∂z − ∂τxz ∂x − ∂τyz ∂y = Fz (6.4) (6.5) que l'on peut résumer par

−∇.σ = ~F

Pour pouvoir calculer les déplacements et les contraintes dans l'objet sur lequel est exercée une force, il faut donc maintenant dénir tous les paramètres.

6.2 Fabrication du modèle de plots dans un socle en

PDMS

Il faut en premier lieu créer l'objet. Ici, ce sera un parallélépipède aux dimensions voulues (les côtés mesurant de quelques dizaines à une centaines de µm) surmonté de un à plusieurs cylindres de 1 ou 5 µm de diamètre et de 5 ou 20 µm de haut. Les propriétés physiques (E, ν) de ces éléments doivent être ajustées aux condi- tions expérimentales, ainsi que le type de matériau : pour nous, il est isotrope (voir gure 6.1). Une fois ces propriétés mécaniques dénies, les conditions aux limites doivent l'être. Tout d'abord, il faut xer la base du socle, et aussi lier le cylindre et le socle entre eux. Sans cela, on ne pourra pas avoir de convergence. Il faut également choisir si on considère le plot comme étant encastré ou au contraire dans un maté- riau élastique. Ensuite les forces doivent être cartographiées. En eet, il est possible

Figure 6.1  Diérentes étapes-clé de l'analyse par éléments nis. De gauche à droite et de haut en bas, les caractérisations physiques du matériau, la valeur de la force sur une surface données, les conditions aux limites (ici au socle), le résultat du maillage, diérent dans le cylindre et dans le socle

d'exercer des forces aussi bien sur une surface, en un point que sur une arête. Pour une surface (resp. une arête), on considérera une force surfacique (resp. linéique).

On peut alors dénir le maillage, qui peut être diérencié en fonction de la zone de l'objet (ici socle et cylindre), la précision nécessaire n'étant pas forcément la même partout.

Il sut alors de lancer la résolution du problème à l'aide de ces paramètres. On peut alors représenter le déplacement de l'objet, mais aussi les contraintes dans le matériau.

6.2. Fabrication du modèle de plots dans un socle en PDMS 87

Figure 6.2  Représentation du champ des déplacements dans un plot de 20 µm de haut de de 5 µm de diamètre. Le bleu représente les déplacements les plus faibles, le rouge les plus grands

Nous donnerons les résultats découlant de cette utilisation en regard des expé- riences correspondantes.

Troisième partie

Résultats

Chapitre 7

Inuence de la rigidité du substrat et

des forces exercées par les cellules

sur les fonctions cellulaires

Sommaire

7.1 Inuence de la rigidité du substrat . . . 92 7.2 Relation force-raideur . . . 95 7.3 Comparaison avec les substrats semi-innis élastiques . 96 7.4 Étalement cellulaire et taille des adhésions focales . . . . 98 7.5 La migration est inuencée par la rigidité . . . 102 7.6 Résultats des simulations par COMSOL . . . 103 7.6.1 Relation force-déplacement . . . 103 7.6.2 Inuence de la déexion du plot sur le comportement du

socle . . . 104 7.7 Conclusion . . . 105 Pour adhérer et migrer, les cellules exercent des forces sur leur environnement. Dans leur environnement naturel, les propriétés mécaniques de la matrice extra- cellulaire peuvent être très variées. Des études récentes montrent notamment que la rigidité a une inuence sur les forces développées, mais aussi sur l'organisation de l'architecture interne de la cellule, de façon corrélée. Dans ce contexte, nous avons utilisé les substrats de micropiliers décrits dans la partie 2.1.1 pour tester l'inuence de la rigidité sur les forces, l'adhésion et la migration des cellules. En eet, les cellules vont exercer des forces sur leur support, déterminées à partir des déexions des plots. En modiant les dimensions des plots, il est possible de varier leurs propriétés mécaniques, telles que leur raideur, leur densité et d'étudier leur inuence sur le comportement cellulaire. Nous avons montré précédemment dans l'équipe (Saez et al., 2005; Saez, 2006; Saez et al., 2007) que la rigidité du substrat inuence le comportement de cellules épithéliales (des MDCK). Nous allons montrer que ce comportement se retrouve avec des cellules individuelles, des broblastes.

7.1 Inuence de la rigidité du substrat sur l'ampli-

tude des forces

Nous avons employé des plots de 1 ou 2 µm de diamètre, leur hauteur variant de 1,4 à 7 µm de hauteur. La gamme des raideurs correspondantes est donnée dans la table 7.1. Dans un régime de faibles déformations, F = kδx, connaître la déformation

Diamètre des plots (µm) Hmini (µm) kmaxi (nN/µm) Hmaxi (µm) kmini (nN/µm) 1 1,4 118 6,5 1,1 2 2,8 214 7 13

Table 7.1  Valeurs des raideurs en fonction de la hauteur et du diamètre des plots

et les dimensions des plots permet de déterminer les forces correspondantes. Ces plots ont été recouverts de bronectine comme expliqué partie 4.3 puis des cellules ont été déposées (broblastes 3T3 ou MDCK). L'activité des cellules sur ces plots a été alors enregistrée par vidéo-microscopie. On a pu analyser la déexion des piliers à l'aide d'un programme développé au laboratoire. Ensuite, nous avons mesuré ce qu'on a nommé la force maximale et la force moyenne sous la cellule ou l'îlot de cellules, dénies sur la gure 7.3.

Rappel bref sur la méthode de détection des plots Le programme réalisé au laboratoire, écrit en Visual Basic, utilise le réseau parfait de plots au repos pour déterminer leur déplacement.

Tout d'abord, il faut déterminer la position au repos. Cette partie est réalisée manuellement, en entrant les directions et le pas du réseau (voir gure 7.1). Une position de base est donc déterminée pour tous les plots, position qui sera anée lors des étapes suivantes. Ensuite il faut donner au logiciel la nature des plots : recouverts/en contact avec la cellule ou au repos. On déterminera le déplacement de ceux en contact avec la cellules, les autres plots restant au repos serviront de base pour calculer la position non dééchie des plots recouverts.

Pour calculer leur position, on cherche, dans une fenêtre de rayon ajustable (voir gure 7.1) les pixels dont l'intensité est supérieure à un seuil valant un pourcentage ajustable du maximum dans cette fenêtre. Ces pixels sont ceux représentant le som- met du plot. En calculant leur barycentre, on trouve le centre du plot dééchi. On obtient donc la position des plots à l'instant t.

Pour mesurer le déplacement, on a besoin de connaître la position théorique du plot dééchi lorsqu'il est au repos. Elle n'est pas accessible expérimentalement, on utilise donc l'arrangement régulier des plots pour la déterminer. On calcule la posi- tion du centre des plots non dééchis qui est le barycentre des pixels les plus brillants

7.1. Inuence de la rigidité du substrat 93

Figure 7.1  Fenêtre du programme d'analyse du mouvement des plots. La fenêtre réseau permet de repérer manuellement et relativement grossièrement l'organisation des plots en amont de l'analyse. Le rayon dans lequel se fait cette analyse est fonction de la distance inter-plots mais aussi d'un paramètre overlap que l'on peut modier. Il est également possible de faire varier le seuil en dessous duquel les pixels ne sont pas pris en compte pour la détermination du barycentre.

comme vu précédemment puis, à l'aide de tous les plots alignés non dééchis, on détermine l'équation de la droite passant par ces centres grâce à une régression li- néaire (voir gure 7.2). Si on fait cela pour deux droites auxquelles appartient le plot dééchi, l'intersection de ces deux droites donne les coordonnées de la position au repos théorique. On est alors en mesure de calculer le déplacement de tous les plots dééchis, sous réserve qu'il y ait susamment de plots pour eectuer la régression linéaire.

Une fois que l'on connaît le déplacement de chaque plot à chaque instant, il est possible de calculer la résultante, de suivre l'évolution d'un plot au cours du temps ou au contraire d'établir à un instant donné la cartographie des déplacements.

Lorsque la cellule n'est que sur le haut des plots, on peut considérer, comme on l'a vu partie 2.1.1, que la force est proportionnelle au déplacement. Cependant, nous verrons que lorsque l'intervalle entre deux plots augmente, les cellules peuvent péné- trer entre les plots et adhérer le long des plots. La relation linéaire force/déplacement n'est alors plus valable.

Les forces maximales, que ce soit sur cellules individuelles (broblastes) ou îlots de cellules (MDCK), se situent sur la périphérie, comme cela a été vu précédemment (Munevar et al., 2001; Tan et al., 2003; Saez et al., 2005). L'incertitude des forces

Figure 7.2  Les plots, y compris ceux qui sont dééchis, sont repérés par le programme (plots entourés en rouge). Les droites de régression linéaire sont rendues apparentes pour les trois plots dééchis (droites vertes), ainsi que les déplacements des plots (èches jaunes)

Figure 7.3  Répartition des forces au niveau de chaque micro-pilier sous une cellule au cours du temps. On dénit Fmax comme étant la force moyenne des forces situées en queue de distribution et Fmoyenne comme étant la moyenne de cette distribution

est corrélée à celle des déplacements (fonction de la sensibilité de la caméra ainsi que de l'objectif) qui est d'environ 30 nm. Elle varie de 0,03 à 6 nN en fonction de la raideur.