Prélèvements et analyses

Des séries de 11 prélèvements (correspondant aux 11 points de prélèvement du réseau) ont été effectuées avant et après les traitements de désinfection testés, afin d’évaluer leur efficacité. Les méthodes standard recommandées par l’AFNOR ont été suivies pour les prélèvements et les analyses microbiologiques.

III.2.2.1 Prélèvements

Les robinets de prélèvements ont été flambés au chalumeau pendant 15 secondes. Après refroidissement du robinet, le premier jet a été éliminé puis l'EMN a été collectée dans des flacons de polyéthylène haute densité (ADL & Prochilab, Lormont, France) de 1 L ou 250 mL, stérilisés par ionisation et ne contenant aucun neutralisant (les prélèvements étant constitués d’EMN ne contenant pas de désinfectant). Les analyses ont été réalisées immédiatement après prélèvements ou dans les 24 h suivantes avec conservation des échantillons à 4 °C.

III.2.2.2 Analyses physico-chimiques de l’eau

La température de l’eau circulant dans le réseau a été contrôlée grâce aux 4 thermomètres intégrés sur les canalisations. La température a été relevée quotidiennement en 4 points du réseau, lorsque le réseau fonctionnait en système ouvert.

Le pH et la conductivité ont été relevés pour chaque série d’analyses de 11 prélèvements. Le pH de l’eau a été mesuré sur des échantillons récoltés dans des flacons de polyéthylène haute densité (ADL Prochilab), non acidifiés, à l’aide d’un pH-mètre (Hach, Loveland, CO, États- Unis) étalonné avant chaque mesure. Les mesures ont été effectuées immédiatement après les prélèvements.

La conductivité a été mesurée sur des échantillons d’eau non acidifiés, prélevés dans des flacons de polyéthylène haute densité (ADL Prochilab) au moyen d’un conductimètre (Hach). Le conductimètre était étalonné par des solutions de KCl de concentrations et conductivités connues. Les mesures ont été effectuées immédiatement après prélèvements.

Les concentrations ioniques des eaux circulant dans le réseau (eau d’adduction de la ville de Dax et eau minérale naturelle) ont été déterminées par chromatographie ionique à l’aide d’un appareil ICS-1100 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) sur colonnes échangeuses d’anions (IonPac AS18 Hydroxide-Selective Anion-Exchange Column, Dionex) ou de cations (IonPac CS16 Cation-Exchange Column, Dionex). Les échantillons d’eau (non acidifiés) ont été prélevés dans des flacons de polyéthylène haute densité et analysés immédiatement après les prélèvements. Une analyse des cations et une analyse des anions ont précédé chaque essai. Les résultats ont été comparés aux analyses effectuées par la Régie des Eaux de Dax, en charge des analyses trimestrielles des EMN et EAP de la ville de Dax.

III.2.2.3 Analyses microbiologiques de l’eau minérale naturelle

Analyse de la variation de flore hétérotrophe revivifiable à 22 (FT 22) et 37 °C (FT 37)

(AFNOR, 1999)

2 mL d'eau à analyser (ou d'une dilution décimale de l'échantillon) ont été déposés dans 2 boîtes de Petri dans lesquelles ont été incorporés environ 15 mL de PCA (Plate Count Agar, Oxoïd, Dardilly, France) maintenu en surfusion. Une fois le milieu solidifié, une des boîtes a été placée à 37±2 °C (pendant 48 h) pour le dénombrement de la FT 37, et l’autre à 22±2 °C (pendant 72 h) pour le dénombrement de la FT 22. Le résultat est donné en UFC/mL.

Recherche et dénombrement de coliformes totaux et thermotolérants (AFNOR, 2000)

250 mL d'EMN à tester ont été filtrés sur une membrane stérile en ester de cellulose de porosité nominale 0,45 µm (Pall, East Hills, NY, États-Unis). La membrane a ensuite été transférée sur un milieu gélosé TTC (2,3,5-triphényltérazoliumchloride)-tergitol (Oxoïd). Le temps d'incubation était de 48 h, à 37±2 °C pour la recherche de coliformes totaux et à 44±2 °C pour la recherche de coliformes thermotolérants. Les colonies jaunes entourées d'un halo jaune constituées de bacilles à Gram négatif (coliformes présumés) ont été repiquées sur gélose TSA (Tryptone Soja Agar, Oxoïd) pour la recherche d'oxydase et en bouillon tryptophane pour vérifier la production d'indole. Le résultat est donné en UFC/250mL.

Recherche et dénombrement d’entérocoques intestinaux (AFNOR, 2000)

250 mL d'eau à tester ont été filtrés sur membrane en ester de cellulose de porosité nominale 0,45 µm (Pall). La membrane a ensuite été transférée sur gélose Slanetz et Bartley (Oxoïd). Le temps d'incubation était de 48 h à 37±2 °C. Lorsque des colonies roses ou brunes, constituées de coques à Gram positif, était présentes, la membrane de filtration a été transférée sur gélose BEA (Bile Esculine Agar, Oxoïd) et incubée à 44±2 °C pendant 2 h. Les colonies d'entérocoques ont été confirmées par la présence d’un halo noir. Le résultat est déterminé en UFC/250mL.

Recherche et dénombrement de spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices

(AFNOR, 1993)

100 mL d'eau à tester ont été chauffés au bain-marie à 75±1 °C pendant 15 min. L'échantillon refroidi a été filtré sur membrane stérile (porosité nominale 0,2 µm, Pall). La membrane a été placée sur gélose TSC base (Tryptone-Sulfite-Cyclosérine, Oxoïd), le côté comportant les bactéries au contact de la gélose. La boîte a été incubée en anaérobiose à 37±2 °C pendant 48 h. Les colonies noires, correspondant aux bactéries anaérobies sulfito-réductrices, ont alors été dénombrées. Le résultat est donné en UFC/100mL.

Recherche et dénombrement de P. aeruginosa (AFNOR, 2002)

250 mL d’échantillon ont été filtrés sur une membrane stérile en ester de cellulose de porosité nominale 0,45 µm (Pall). La membrane a ensuite été transférée sur le milieu CN (Cétrimide Acide Nalidixique, Oxoïd). Après 48 h d'incubation à 37±2 °C, des colonies bleues à vertes et fluorescentes sous lampe UV (360 nm) sont considérées comme étant P. aeruginosa. Des colonies fluorescentes ne présentant pas de coloration bleu-vert, constituées de bacilles à Gram négatif peuvent aussi apparaître. Dans ce cas, elles ont été repiquées dans un bouillon acétamide pour vérifier leur capacité à produire de l'ammoniac à partir d'acétamide et confirmer ainsi leur appartenance à l’espèce P. aeruginosa. Le résultat est rendu en UFC/250 mL.

Recherche et dénombrement de L. pneumophila (AFNOR, 2003)

200 µL d'échantillon à analyser ont été étalés directement sur gélose GVPC (Glycine- Vancomycine-Polymyxine-Cycloheximide, Oxoïd). Parallèlement, 1 L d'échantillon a été filtré sur une membrane de polycarbonate de porosité nominale 0,4 µm (Pall). La membrane a été placée dans un flacon contenant 5 mL d'eau échantillonnée. Les légionelles ont été détachées de la membrane par un traitement aux ultrasons de 3 min, afin d’obtenir un concentrat.

100 µL de concentrat (ou d'une dilution au 1/10ème du concentrat) ont été étalés directement sur GVPC. Parallèlement, 2 mL ont été chauffés à 50 °C pendant 30 min (échantillon traité thermiquement) et 2 mL ont été mélangés à 2 mL de tampon acide (pH=2, 5 min à température ambiante ; échantillon traité chimiquement). 100 µL des échantillons traités

thermiquement et 200 µL des échantillons traités chimiquement ont été étalés sur deux géloses GVPC. L’ensemble des boîtes a été incubé en enceinte fermée (pour éviter l'évaporation des milieux gélosés) à 37±2 °C pendant 10 jours.

Les colonies de légionelles présumées (gris bleu, avec un aspect de verre fritté et constituées de bacilles à Gram négatif) ont été repiquées successivement sur gélose BCYE (Buffered Charcoal Yeast Extract) sans cystéine (Oxoïd), Columbia au sang de mouton (Oxoïd) et BCYE avec cystéine (Oxoïd). Les colonies constituées de bacilles ne se développant que sur BCYE + cystéine appartiennent au genre Legionella. Un test au latex (Legionella Latex Test, Oxoïd) a permis de vérifier s'il s'agissait de l’espèce L. pneumophila et, le cas échéant, de définir le sérogroupe des colonies. Les résultats sont exprimés en UFC/L.