Matériel et méthodes
III. 3.2.4.4 Analyses d’images
Les séries d’images enregistrées au format leica (.lei) ont été analysées grâce au logiciel Image J, disponible librement sur internet (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Image J est un système ouvert dont les fonctions sont des extensions (ou plugins) Java. Des systèmes d’acquisition, d’analyse, et de traitement d’images personnalisés peuvent ainsi être développés par les utilisateurs, en utilisant l’éditeur Image J et Java. Les analyses d’images décrites dans cette étude ont été réalisées grâce aux extensions « Volume Viewer », « Ortview » et « Volume J ». Plusieurs types d’images ont ainsi été obtenues (voir Figure III-6) :
⇒ Des aplatissements, ou « écrasements » verticaux, superposition de toutes les images d’une même série (projections maximales). Le résultat est une image dont les côtés représentent les coordonnées x et y ;
⇒ Des « écrasements » de profil, dont les côtés représentent un axe x-z ;
⇒ Des reconstitutions volumiques : les données selon x, y et z de toutes les images d’une série sont synthétisées en 3 dimensions.
III.3.2.5 Analyses statistiques
Les quantifications bactériennes sont des moyennes effectuées sur 2 essais. Les valeurs obtenues à différents temps, dans différentes conditions de culture (température) ou pour différentes espèces ont été comparées au moyen du test t de Student réalisé à l’aide du logiciel MS Excel. Des valeurs de p inférieures ou égales à 0,01 indiquent des résultats statistiquement différents.
III.3.3
Évaluation in vitro de l’effet bactéricide à court et à moyen terme
d’un choc thermique à 80 °C sur biofilms à L. pneumophila
Des biofilms de L. pneumophila (souche HW S2-14) de 9 j ont été obtenus selon le protocole déjà décrit, en utilisant le milieu SBB, et un inoculum de 102 UFC/mL. Pour chaque microplaque, un témoin positif a été effectué (puits inoculé non exposé au traitement) ainsi qu’un témoin négatif (puits non inoculé).
La microplaque a été incubée 9 j à 37±2 °C, en sachet fermé afin de limiter l’évaporation. Le milieu de culture a été renouvelé 3 et 6 j après inoculation : les puits sont vidés délicatement, rincés deux fois avec 2 mL d’EDS puis ont reçu 2 mL de milieu SBB neuf.
Le traitement biocide a été appliqué après 9 j d’incubation, sur des biofilms considérés comme matures. Les microplaques ont été fermées hermétiquement et placées au bain-marie à 80 °C pendant 1 h, excepté les microplaques contenant les puits témoins qui n’ont subit aucun traitement.
Les prélèvements de biofilm ont été effectués en suivant le protocole décrit au chapitre III.3.2.2. Pour évaluer la recolonisation du milieu par des bactéries qui auraient résisté au traitement, de nouveaux prélèvements ont été effectués 3 et 6 j après choc thermique.
et que le nombre de bactéries adhérées dans les puits témoins positifs dépassait 5,5 log d’UFC/puits. L’efficacité de la désinfection a été exprimée en réduction logarithmique (RL). La RL pour les cellules en biofilm a été obtenue en retranchant le nombre d’UFC moyen des puits n’ayant pas subi de traitement (témoins positifs) au nombre de log d’UFC restant dans le puits ayant subi le choc thermique.
III.4 Évaluation in situ de l’effet bactéricide à court et à
moyen terme d’un choc thermique à 80 °C sur une
contamination à L. pneumophila
Deux essais in situ ont été réalisés sur le réseau d’EMN contaminé. Le protocole utilisé a été adapté du protocole utilisé pour P. aeruginosa décrit au chapitre III.2.
III.4.1
Préparation de l’inoculum et inoculation du réseau-pilote
Compte tenu du caractère fastidieux de la culture de L. pneumophila, le milieu R2A n’a pas pu être utilisé pour la préparation de l’inoculum. Le milieu de culture classique, BYE (Ristroph et al., 1980), a été utilisé. L’inoculum a été préparé à partir de colonies de L. pneumophila (souche HW S2-14) issues d’un repiquage sur BCYE (1er repiquage après décongélation) et mises en suspension dans 5 mL d’EDS. Cette suspension a été transvasée dans un Erlenmeyer contenant 50 mL de milieu BYE puis incubée sous agitation magnétique (400 rpm) pendant 24 h à 37±2 °C. Cette culture a ensuite été transvasée dans 1 L de milieu neuf. L’incubation s’est poursuivie pendant 12 h. La suspension bactérienne obtenue a alors centrifugée à 4500 rpm pendant 10 min, à température ambiante. Le culot bactérien a été remis en suspension dans 300 mL d’EDS. L’opération a été renouvelée 3 fois pour éliminer au maximum le milieu de culture. La concentration bactérienne a été mesurée par étalement de 100 µL d’échantillon (et des dilutions décimales suivantes) sur BCYE+cystéine. Cette concentration s’élevait alors à (6,55±0,64)×106 UFC/mL. L’inoculum ainsi préparé a été versé dans le ballon du réseau-pilote contenant 400 L d’EMN à 40 °C. L’eau contaminée a ensuite été mise en circulation dans l’ensemble du réseau pendant 30 min puis mise à stagner pendant 48 h afin de favoriser l’adhésion des cellules et, éventuellement, la formation d’un biofilm.
III.4.2
Prélèvements et analyses
Les prélèvements et analyses effectués sont décrits dans la partie III.2.2, exceptés les dénombrements de L. pneumophila qui ont été effectués seulement par qPCR : les robinets de prélèvement ont été flambés au chalumeau pendant quelques secondes. Après refroidissement du robinet, le premier jet a été éliminé puis 1 L d’EMN a été collecté dans un flacon de polyéthylène haute densité (ADL Prochilab). Les échantillons d’eau pour les analyses de L. pneumophila ont été filtrés sur membranes de polycarbonate stérile (porosité nominale 0,45 µm, Pall) et ces membranes ont été conservées à -20 °C pendant moins d’une semaine. Les quantifications ont été réalisées par qPCR selon le protocole décrit dans la partie III.3.2.2.2. Les résultats expriment la concentration moyenne (en log UG/L) sur les onze points de prélèvement.
III.4.3
Traitement de désinfection par choc thermique
Les chocs de désinfection thermiques ont été effectués selon le protocole décrit paragraphe III.2.3.1.