au choc thermique
V.3 Évaluation de l’activité du choc thermique sur L.
V.3.2 Évaluation in situ d’un choc thermique sur une contamination à L pneumophila en réseau d’eau minérale naturelle
Dans la première partie de cette thèse, nous avons pu constater que P. aeruginosa est une bactérie formant facilement des biofilms, d’où sa résistance aux traitements biocides. Cette résistance, ou plutôt réduction de sensibilité, a été notamment illustrée lors des essais sur biofilms obtenus en microplaque et ceux menés sur réseau-pilote. Lors de ces derniers essais, les traitements ont permis l’élimination transitoire de la bactérie dans l’EMN, sans parvenir à éradiquer complètement la contamination : la bactérie était à nouveau détectée quelques jours après le traitement.
Dans les paragraphes précédents, nous avons également vu que L. pneumophila était une bactérie capable de former des biofilms dans certaines conditions, ce qui pourrait avoir une implication dans sa résistance aux traitements de désinfection. Pour vérifier si le comportement de L. pneumophila est semblable à celui de P. aeruginosa en conditions de traitement réelles, nous avons donc procédé à des contaminations du réseau-pilote. Le choix s’est porté sur une souche environnementale de L. pneumophila (souche HW S2-14) pour la réalisation des essais plutôt qu’une souche de référence, afin d’optimiser la contamination du réseau. Ces résultats sont également décrits dans un article paru dans la « Presse Thermale et Climatique » (Annexe 6).
Deux essais indépendants ont été menés et ont permis d’évaluer l’efficacité in situ d’un choc thermique. La contamination du réseau a été réalisée à partir d’une suspension de 300 mL de L. pneumophila ((6,55±0,64)×106 UFC/mL) inoculée au niveau du ballon du réseau préalablement rempli d’EMN. Le réseau a ensuite été utilisé quotidiennement pendant 1 h. La contamination du réseau par L. pneumophila a été suivie pendant 16 ou 22 jours, par des analyses au niveau des 11 points de prélèvements du réseau. La recherche de L. pneumophila s’est effectuée sur 2×1 L d’EMN par dénombrement par culture sur GVPC et qPCR. Cependant, la technique par culture ayant mené à des résultats ininterprétables (présence d’une flore interférente importante empêchant la lecture), seuls les résultats de qPCR ont été exploités.
Les autres paramètres microbiologiques (coliformes dans 250 mL, entérocoques dans 250 mL, spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices dans 100 mL, P. aeruginosa dans 250
mL) ont été suivis par les méthodes classiques de culture sur boîte. Aucune de ces bactéries n’a été détectée dans les volumes indiqués durant les deux essais. Le pH, la température, la pression et les concentrations ioniques de l’EMN n’ont pas varié anormalement au cours des essais.
Pendant les essais, des chocs thermiques ont été appliqués (EAP à 80 °C mise en circulation pendant 1 h 30 min dans le réseau, circuit fermé). Un choc thermique unique a été appliqué lors de l’essai 1, à 15 j. Deux chocs thermiques ont été appliqués au cours de l’essai 2, à 6 j et à 15 j (Figure V-4). La contamination initiale du réseau s’élevait à 6,25±0,52 log UG/L dans l’eau en circulation 2 ou 3 jours après l’inoculation en moyenne (n=2).
A B
Figure V-4. Évolution de la concentration en L. pneumophila dans l’EMN en circulation dans le réseau-pilote (moyennes ±écarts-types). A. Essai 1. B. Essai 2. Les flèches
représentent les chocs thermiques à 80 °C.
La Figure V-4 A montre les résultats obtenus lors du premier essai et indique que la contamination initiale en L. pneumophila ne s’est pas maintenue dans le réseau. Le niveau de L. pneumophila est en effet passé de 5,89±0,22 log UG/L (2 j) à 4,20±0,32 log UG/L (14 j). On observe également une diminution de la concentration en L. pneumophila dans le réseau suite au choc thermique (p<0,01). Cette diminution de concentration ne peut pas être attribuée à la seule réalisation du choc thermique, la concentration en L. pneumophila n’étant pas stabilisée dans le réseau. Cependant, il apparaît déjà clairement que le choc thermique ne permet pas d’obtenir une réduction totale de la contamination (3,57 log UG/L encore
présentes après le choc).
Lors du deuxième essai (Figure V-4 B), les concentrations initiales en L. pneumophila dans l’EMN en circulation dans le réseau ont varié entre 6,62±0,25 et 4,66±0,34 log UG/L. Une diminution de la concentration en L. pneumophila a été observée à la suite du premier choc thermique, mais comme dans le cas du premier essai, la concentration n’était pas stable et la diminution ne peut pas être attribuée au seul choc thermique. Ce premier choc, associé à la diminution de flore au sein du réseau, ne permet pas une réduction drastique de la population présente. Un second choc thermique a donc été appliqué au jour 15 et n’a engendré aucune variation de la concentration en UG au sein du réseau. La concentration dans le réseau est restée uniformément stable du jour 7 au jour 22 et à des taux nettement supérieurs aux limites acceptables.
Les études de traitements bactéricides sur L. pneumophila n’ont, pour le moment, concerné que le choc thermique à 80 °C. Ce traitement a en premier lieu été appliqué à des biofilms de L. pneumophila formés in vitro en milieu SBB. Les quantifications effectuées après traitement par culture sur boîte n’ont pas permis de détecter de bactérie cultivable. Cependant, ce traitement pouvant entraîner la formation de bactéries sous forme VBNC, il serait intéressant de poursuivre les essais en utilisant des techniques de quantifications alternatives.
Dans un deuxième temps, des essais en réseau-pilote ont été effectués. Les résultats obtenus sur réseau contaminé par P. aeruginosa ont permis de montrer qu’un traitement par choc thermique avait une efficacité transitoire : immédiatement après traitement, aucune bactérie cultivable n’était détectée dans le réseau, alors que quelques jours après le choc, quatre points de prélèvements présentaient à nouveau une contamination. Dans le cas de L. pneumophila, les essais ont montré que le choc thermique n’induisait aucune diminution de la concentration bactérienne (en log UG/L) dans l’eau du réseau, quel que soit le point de prélèvement considéré. De tels échecs de désinfection ont déjà été décrits dans la littérature et ont souvent plusieurs origines. L’ensemble de ces résultats sera discuté dans le paragraphe V.4. Les techniques de détection utilisées dans les essais in vitro et in situ doivent, quoiqu’il en soit, être harmonisées afin de mieux comprendre les différences de sensibilité de la bactérie dans les 2 types d’essais et éventuellement détecter la présence de bactéries sous forme VBNC.
V.4 Discussion
La discussion concernant la mise au point du modèle de formation du biofilm en microplaque est détaillée dans l’article « Sessile Legionella pneumophila is able to grow on surfaces and generate structured mono-species biofilms » et ne sera donc pas reprise ici.