Mode contact

3. Mode contact intermittent. ... 45 II – Mode contact intermittent : aspects instrumentaux. ... 47 A. Utilisation du mode contact intermittent à l’air. ... 47 1. Propriétés de la résonance. ... 47 2. Modélisation de l’interaction pointe-surface. ... 48 B. Utilisation du mode contact intermittent en milieu liquide. ... 49 1. Modes d’excitation de l’oscillation. ... 50 2. Facteur de qualité de la résonance. ... 51 3. Modélisation de l’interaction pointe-surface. ... 52 C. Temps d’acquisition des images. ... 53 1. Paramètres de construction intrinsèques à l’instrument. ... 53 1.1. Bande passante du convertisseur RMS-DC. ... 53 1.2. Bande passante de la rétroaction (boucle PID + scanner). ... 54 2. Fréquence de résonance des microleviers. ... 54 3. Paramètres d’imagerie. ... 55

3.1. Nombre de pixels de l’image. ... 55 3.2. Le problème de la dérive. ... 55 4. Performances. ... 56

4.1. Avec un AFM commercial. ... 56 4.2. Avec un AFM spécialisé. ... 56 III – Principales applications de l’AFM en biologie. ... 56 A. Biomolécules. ... 56 1. Imagerie. ... 56 2. Courbes force-distance. ... 57 B. Membranes ... 57 1. Imagerie. ... 57 2. Courbes force-distance. ... 57 C. Cellules. ... 58 1. Imagerie. ... 58 2. Courbes force-distance. ... 59 D. CryoAFM. ... 59 Conclusion. ... 59 Bibliographie du chapitre 2. ... 61

CHAPITRE 2

Les différents modes de fonctionnement de l’AFM et leurs applications en biologie. Introduction

Le chapitre précédent a situé les spécificités de l’AFM, outil de mesure de force et outil d’imagerie, parmi les différentes techniques d’étude de l’ADN et des interactions ADN-protéines. Même s’il a d’abord été conçu pour des applications en physique (caractérisation topographique et/ou mécanique locale de matériaux,…) cet instrument a en effet un potentiel important pour de nombreuses applications en biologie. En imagerie, la nature des objets biologiques empêche d’atteindre une résolution aussi élevée que sur des matériaux physiques, qui sont en général bien plus durs, plus inertes et plus stables. Elle reste cependant du même ordre de grandeur : le nanomètre en résolution latérale et l’angström en résolution verticale. Cette résolution dépend avant tout de l’interaction entre la pointe et la surface de l’échantillon, l’objectif étant d’interagir suffisamment avec l’objet (pour être sensible à ses détails) tout en minimisant la force que la pointe lui fait subir (pour éviter de le détériorer). Plusieurs modes de fonctionnement de l’AFM ont été développés, qui diffèrent principalement par la manière dont la pointe interagit avec l’échantillon.

I - Principes des différents modes de fonctionnement.

Figure I-1 : Schéma de principe de l’AFM.

L’AFM fait partie de la famille des microscopes dits « à sonde locale ». Le précurseur de l’AFM, le microscope à effet tunnel (Scanning Tunelling Microscope ou STM en anglais), a été inventé en 1982 (1) par Binnig et Rohrer tandis que l’invention de l’AFM par Binnig, Quate et Gerber remonte à 1986 (2). Les organes essentiels de l’AFM sont schématisés sur la

figure I-1. Une pointe de dimensions nanométriques (~10-20 nm typiquement) située à l’extrémité d’un microlevier (cantilever en anglais) est approchée d’une surface et soit déplacée verticalement, pour construire une courbe force-distance, soit balayée latéralement

relativement à la surface de l’échantillon, pour construire une image. Les déplacements sont commandés par les déformations d’une céramique piézoélectrique sous l’effet de la tension qui lui est appliquée. Les déformations du microlevier en fonction de l’interaction pointe-surface sont suivies par un faisceau laser réfléchi sur le microlevier vers une photodiode à quatre cadrans, qui convertit les déplacements du spot lumineux en signaux électriques. Ceux-ci sont traités par une électronique et une informatique de contrôle, et la répétition de ce processus pour différentes positions verticales ou dans une zone de balayage aboutit respectivement à la construction d’une courbe force-distance ou à la construction d’une image tridimensionnelle de la surface de l’échantillon.

A - Courbes force-distance (AFM 1D).

Les courbes force-distance sont obtenues en modulant la position verticale de l’échantillon et en enregistrant la déflection du microlevier, sans balayer latéralement la surface de l’échantillon. L’amplitude verticale maximale de déplacement est de quelques µm. La figure I-2 représente une courbe de force typique, avec un schéma représentatif de la déflection du microlevier en différents points de la courbe. La force est déduite de la déflection du microlevier en multipliant par la constante de raideur du microlevier, en général déterminée expérimentalement avec l’une des méthodes de calibration existantes (décrites par exemple dans (3)). Eventuellement, les courbes force-distance peuvent être enregistrées en chaque point d’une surface pour réaliser une image d’élasticité ou d‘adhésion ; on parle alors d’imagerie en pulsed-force mode.

Figure I-2 : Construction d’une courbe force-distance en AFM. Figures d’après (4). B – Modes d’imagerie.

Quel que soit le mode d’imagerie, le balayage latéral de la surface est effectué ligne par ligne. La surface totale balayée peut aller jusqu’à quelques milliers de µm² ; la surface

A) Loin de la surface : ~ pas de déformation (en l’absence de forces à longue portée)

B) Au fur et à mesure de l’approche il y a attraction puis saut au contact

C) La pointe appuie sur la surface

D) L’adhésion maintient la pointe sur la surface au début du retrait

maximale précise dépend du piézoélectrique utilisé. La résolution latérale atteinte sur les objets biologiques est de l’ordre de quelques nanomètres et la résolution verticale de l’ordre de quelques angströms. L’analyse des différents régimes de forces d’interaction pointe-surface en fonction de la distance permet de récapituler comment se fait l’imagerie dans les différents modes de fonctionnement : contact, non contact, contact intermittent (figure I-3).

Figure I-3 : Régimes de force couverts par les différents modes d’imagerie.

1. Mode contact.

Figure I-4a : Principe de l’imagerie en mode contact à hauteur constante. Le microlevier est balayé à hauteur constante au-dessus de la surface et se déforme en fonction du relief rencontré par la pointe. Le déplacement du spot laser suit la déformation du microlevier.

Distance Force

Mode non contact

Mode contact intermittent Mode contact

Régime répulsif

Régime attractif

Figure I-4b : Principe de l’imagerie en mode contact à force constante. La position verticale de l’échantillon est ajustée en permanence grâce à une boucle électronique de rétroaction pour maintenir la déflection du microlevier à une valeur constante. L’image du relief de la surface est reconstruite à partir des corrections de la position verticale de l’échantillon.

Le mode contact est le premier mode d’imagerie AFM à avoir été développé. La force d’interaction entre la pointe et la surface reste dans le régime répulsif. Ce mode d’imagerie peut fonctionner soit à hauteur constante (le microlevier est balayé à une hauteur constante au-dessus de la surface) soit à force constante (la force avec laquelle le microlevier vient palper la surface est maintenue constante au cours du balayage par l’intermédiaire d’une rétroaction) (figure I-4). Dans les deux cas une image de la topographie de la surface est obtenue. Le mode contact est simple à mettre en œuvre et rapide, mais des forces de frottement importantes sont induites entre la pointe et la surface. Celles-ci risquent de dégrader les objets biologiques, ce qui limite beaucoup l’utilisation de ce mode d’imagerie en biologie.